病毒感染的實驗室檢查包括病毒分離與鑒定、病毒核酸與抗原的直接檢出以及特異性抗體的檢測。臨床醫(yī)師根據(jù)流行病學資料,疾病的癥狀與體征綜合判斷可能為何種病毒感染,留取適宜的標本送檢。
病毒性疾病通常采集血液、鼻咽分泌液、咯痰、糞便、腦脊液、皰疹內(nèi)容物、活檢組織或尸檢組織等。
供分離病毒、檢出核酸及抗原的標本的,要求:
(一)盡早采取在發(fā)病初期(急性期)采取,較易檢出病毒,越遲陽性率越低。
(二)部位適宜由感染部位采取,如呼吸道感染采取鼻咽洗漱液或咯痰;腸道感染采取糞便;腦內(nèi)感染采取腦脊液;皮膚感染采取病灶組織;有病毒血癥時采取血液。
(三)冷藏速送病毒離活體后在室溫下很易死亡,故采得檢材應盡快送檢。若距離實驗室較遠,應將檢材放入裝有冰塊或干冰的空器內(nèi)送檢。病變組織則應保存于50%的甘油緩沖鹽水中。污染檢材,如鼻咽分泌液、糞便等應加入青霉素、鏈霉素或慶大毒素等,以免雜菌污染細胞或雞胚,而影響病毒分離。
檢測特異性抗體需要采取急性期與恢復期雙份血清,第一份盡可能在發(fā)病后立即采取,第二份在發(fā)病后2~3周采取。血清標本放4℃-20℃保存,試驗前血清標本以56℃30分鐘處理去除非特異性物質(zhì)及補體。無菌性腦炎患者也可取腦脊液檢測特異性lgM。
表23-1 病毒檢材采集與檢驗結(jié)果的關(guān)系
采取標本的時期 | 檢查病毒及其成分 | 測定抗體 |
潛伏期及前驅(qū)期 剛發(fā)病或急性期 恢復期及康復期 | 較難查見 最多查見 很難查見 | 未增多 未增多或增多不明顯 明顯增多(常超過4倍) |
臨床表現(xiàn) | 常見病毒 | 幫助診斷有用的檢材 |
呼吸道感染 | 腺病毒 巨細胞病毒 流感病毒 副流感病毒 呼腸孤病毒 合胞病毒 | 咽試、肛拭 咽試或含漱液、尿液 咽拭或含漱液 咽拭含漱液 咽拭、糞便或肛拭 咽拭或含漱液、鼻咽洗液 |
出疹疾病 | 柯薩奇病毒 巨細胞病毒 ?刹《 EB病毒 單純皰疹病毒 麻疹病毒 風疹病毒 水痘帶狀皰疹病毒 | 糞便或肛拭、咽拭 咽拭或含漱液、尿液 糞便或肛拭、咽拭 咽拭或含漱液 病灶棉拭或吸取液、咽拭 咽拭或含漱液、尿液 咽洗液、鼻咽拭 病灶棉拭或吸取液、咽拭 |
腦炎 | 蟲媒病毒 單純皰疹病毒 麻疹病毒 脊髓灰質(zhì)炎病毒 | 血液、腦脊液 腦活檢、腦脊液、皰疹棉拭或吸取液 腦脊液、咽拭或含漱液、尿液 糞便或肛拭、咽拭、腦脊液 |
無菌性腦膜炎 | 柯薩奇病毒 ?刹《 腮腺炎病毒 | 腦脊髓液、糞便或肛拭、咽拭 腦脊液、糞便或肛拭、咽拭 腦脊髓液、口頰粘膜棉拭 |
失天或新生兒感染 | 巨細胞病毒 風疹病毒 單純皰疹病毒 | 尿液、咽拭或含漱液 咽拭或含漱液、尿液 病灶棉拭或吸取液、回拭 |
眼部感染 | 腺病毒 單純皰疹病毒 | 結(jié)膜棉拭、咽拭、肛拭 結(jié)膜棉拭、病灶棉拭或吸取液、咽拭 |
其它感染 巨細胞包涵體疾病 單核細胞增多綜合征 心包炎、心肌炎 | 巨細胞病毒 巨細胞病毒 EB病毒 柯薩奇B病毒 ?刹《 | 尿液、咽拭 尿液、咽拭 咽拭或洗液 心包液、糞便、咽拭 心包液、糞便、咽拭 |
(一)病毒的分離
病毒分離的一般程序是:
檢驗標本→殺滅雜菌(青、鏈霉素)→接種 | 易感的動物→出現(xiàn)病狀 雞胚→病變或死亡 細胞培養(yǎng)→細胞病變 | →鑒定病毒種型(血清學方法) |
細胞系名稱 | 來源 |
二倍體細胞系 HDCS MRC-9 WI-38 傳代細胞系 Hela Hep-2 Vero BHK | 人胚肺細胞 人宮頸癌細胞 人上皮細胞 猴腎細胞 地鼠腎細胞 |
淋巴細胞培養(yǎng)(Lymphocyte culture)正常成熟的淋巴細胞不經(jīng)特殊處理不能在體外傳代培養(yǎng)。然而EBV感染的B淋巴細胞卻能在體外持續(xù)傳代,這是病毒轉(zhuǎn)化細胞的例證,也是分離出EBV的標志。T淋巴細胞在加入T細胞生長因子(IL-2)后可在體外培養(yǎng),為研究人類逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV、HTLV)提供了條件,HIV在T淋巴細胞培養(yǎng)物中增殖形成多核巨細胞。
2.動物試驗這是最原始的病毒分離培養(yǎng)方法。常用小白鼠、田鼠、豚鼠、家兔及猴等。接種途徑根據(jù)各病毒對組織的親嗜性而定,可接種鼻內(nèi)、皮內(nèi)、腦內(nèi)、皮下、腹腔或靜脈,例如嗜神經(jīng)病毒(腦炎病毒)接種鼠腦內(nèi),柯薩奇病毒接種乳鼠(一周齡)腹腔或腦內(nèi)。接種后逐日觀察實驗動物發(fā)病情況,如有死亡,則取病變組織剪碎,研磨均勻,制成懸液,繼續(xù)傳代,并作鑒定。
3.雞胚培養(yǎng)用受精孵化的活雞胚培養(yǎng)病毒比用動物更加經(jīng)濟簡便。根據(jù)病毒的特性可分別接種在雞胚絨毛尿囊膜、尿囊腔、羊膜腔、卵黃囊、腦內(nèi)或靜脈內(nèi),如有病毒增殖,則雞胚發(fā)生異常變化或羊水、尿囊液出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象,常用于流感病毒及腮腺炎病毒等的分離培養(yǎng);但很多病毒在雞胚中不生長。
(二)分離病毒的鑒定
1.病毒在細胞內(nèi)增殖的指征
(1)細胞致病作用(Cytopathogeniceffect,CPE)病毒在細胞內(nèi)增殖引起細胞退形性變,jfsoft.net.cn表現(xiàn)為細胞皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡和脫落。某些病毒產(chǎn)生特征性CPE,普通光學倒置顯微鏡下可觀察上述細胞病變,結(jié)合臨床表現(xiàn)可做出預測性診斷(表23-4)。免疫熒光(IF)法用于鑒定病毒具有快速、特異的優(yōu)點,細胞內(nèi)的病毒或抗原可被熒光素標記的特異性抗體著色,在熒光顯微鏡下可見斑點狀黃綠色熒光,根據(jù)所用抗體的特異性判斷為何種病毒感染。
表23-4 病毒在細胞內(nèi)增殖的指征
病毒 | 增殖指征 |
CPE病毒 小RNA病毒 單純皰疹病毒 腺病毒 副粘病毒 HIV 非CPE病毒 正粘病毒 副粘病毒 風疹病毒 鼻病毒 | 細胞園縮、單層破壞 細胞腫大變園 細胞變園堆積成葡萄狀 多核巨細胞(合胞體) 紅細胞吸附現(xiàn)象 干擾并阻止其他病毒(如ECHO病毒)的細胞致病作用 |
(2)紅細胞吸附現(xiàn)象(Hemadsorptionphenomenon) 流感病毒和某些副粘病毒感染細胞后24-48小時,以細胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素,能吸附豚鼠、雞等動物及人的紅細胞,發(fā)生紅細胞吸附現(xiàn)象。若加入相應的抗血清,可中和病毒血凝素、抑制紅細胞吸附現(xiàn)象的發(fā)生,稱為紅細胞吸附抑制試驗。這一現(xiàn)象不僅可作為這類病毒增殖的指征,還可作為初步鑒定。
(3)干擾現(xiàn)象(Interference phenomenon)一種病毒感染細胞后可以干擾另一種病毒在該細胞中的增殖,這種現(xiàn)象叫干擾現(xiàn)象。前者為不產(chǎn)生CPE的病毒(如風疹病毒)但能干擾以后進入的病毒(如ECHO病毒)增殖,使后者進入宿主細胞不再生產(chǎn)CPE。
2.病毒感染性的定量測定
空斑形成單位 (Plaque-forming unit ,PFU)測定這是一種測定病毒感染性比較準確的方法。將適當濃度的病毒懸液接種到生長單層細胞的玻璃平皿或扁瓶中,當病毒吸附于細胞上后,再在其上復蓋一層溶化的半固體營養(yǎng)瓊脂層,待凝固后,孵育培養(yǎng)。當病毒在細胞內(nèi)復制增殖后,每一個感染性病毒顆粒在單層細胞中產(chǎn)生一個局限性的感染細胞病灶,病灶逐漸擴大,若用中性紅等活性染料著色,在紅色的的背景中顯出沒有著色的“空斑”,清楚可見。由于每個空斑由單個病毒顆粒復制形成,所以病毒懸液的滴度可以用每毫升空斑形成單位(PFU)來表示。
(2)50%致死量(LD50)或50%組織細胞感染量(TCID50)的測定本法可估計所含病毒的感染量。方法是測定病毒感染雞胚,易感動物或組織培養(yǎng)后,引起50%發(fā)生死亡或病變的最小病毒量,即將病毒懸液作10倍連續(xù)稀釋,接種于上述雞胚,易感動物或組織培養(yǎng)中,經(jīng)一定時間后,觀察細胞或雞胚病變,如絨毛尿囊膜上產(chǎn)生痘斑或尿囊液有血凝特性,或易感動物發(fā)病而死亡等,經(jīng)統(tǒng)計學方法計算出50%感染量或50%組織細胞感染量,可獲得比較準確的病毒感染性滴度。
3.病毒形態(tài)與結(jié)構(gòu)的觀察病毒懸液經(jīng)高度濃縮和純化后,借助磷鎢酸負染及電子顯微鏡可直接觀察到病毒顆粒,根據(jù)大小、形態(tài)可初步判斷病毒屬那一科。還可用分子生物學技術(shù)分析病毒核酸組成、基因組織構(gòu)、序列同源性比較加以鑒定。
4.血清學鑒定用已知的診斷血清來鑒定。補體結(jié)合試驗可鑒定病毒科屬;中和試驗或血凝搗蛋制試驗可鑒定病毒種、型及亞型。從病人檢材中分離出病毒株,應結(jié)合臨床癥狀,檢材來源及流行季節(jié)等加以綜合分析,并應注意混雜病毒、隱性感染或潛伏病毒的混淆,須用病人急性期與恢復期雙份血清作血清學試驗,血清抗體滴度有≥4倍以上增高,才有意義。
(一)直接檢出病毒核酸
1.標本滴加到硝酸纖維素膜上,病毒DNA結(jié)合到膜上,在原位進行鹼變性處理后,有放射標記的已知病毒DNA片段雜并,兩條單股核酸按鹼基到補原則結(jié)合成雙股,經(jīng)放射自顯影,陽性結(jié)果出現(xiàn)斑點狀雜交信號。含輪狀病毒的糞便標本經(jīng)熱變性處理,點到膜上,使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標記探針做斑點雜交,敏感性高于ELISA。腸道病毒也可用互補的DNA探針做斑點雜交。
目前核酸分子雜交不但用來檢測急性病人標本中的病毒DNA,也用于檢測不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標本中的病毒DNA。
2.多聚酶鏈反應(Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴增法。先將待檢標本DNA熱變性為單股DNA做為模板,加一對人工合成的與模板DNA兩端各20個鹼基互補的引物,在耐熱DNA多聚酶作用下,使四種脫氧核苷按模板3ˊ端引物向5ˊ端延伸DNA鏈,經(jīng)20~40個循環(huán),可使1個拷貝的核酸擴增至106以上,經(jīng)瓊脂糖電泳,可見到溴化乙錠染色的核酸條帶,擴增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速,已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷,尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標本,有較大應用前景。
(二)直接檢測病毒抗原
1.免疫熒光(IF)技術(shù)如前所述IF可用于細胞培養(yǎng)病毒的鑒定,也適用檢測臨床標本中病毒抗原,具有快速、特異的優(yōu)點。直接免疫熒光技術(shù)是用熒光素直接標記特異性抗體,檢測病毒抗原;間接免疫熒光技術(shù)是先用特異性抗體與標本中抗原結(jié)合,再用熒光素標記的抗體與特異性抗體結(jié)合,從而間接識別抗原?扇⊙屎砻撀浼毎瑱z測呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原;取病灶刮片或腦活檢標本,檢測單純皰疹病毒抗原;取尿沉渣檢測巨細胞病毒抗原等。近年來使用單克隆抗體大大提高了檢測的靈敏度和準確性。
2.免疫酶法(IEA)原理與應用范圍同免疫熒光技術(shù),IEA是用酶(通常是過氧化物酶)取代熒光素標記抗體,酶催化底物形成有色產(chǎn)物,在普通光學顯微鏡下清晰可見,不需熒光顯微鏡,便于推廣使用。
3.放射免疫測定法(RIA)有競爭RIA和因相RNA二種方法。競急RIA是同位素標記的已知抗原與標本中未標記的待檢抗原競爭性結(jié)合特異性抗體的試驗,將形成的復合物分離出來,用放射免疫檢測儀測定放射活性,同時與系列稀釋的標準抗原測定結(jié)果進行比較,確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標本中的抗原,然后加入放射性標記的特異性抗體與抗原結(jié)合,測定放射活性,得知抗原的量。RIA是最敏感的方法,已用于測定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。
4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)先將特異性抗體包被(吸附)到塑料微培板孔中以捕捉標本中相應抗原,然后加入酶標特異性抗體,相應抗原被夾在抗體之間,當加入酶的底物后顯色,顯色程度直接反映了標本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA,又不接觸放射性物質(zhì),已被多數(shù)實驗室采用。
此外,對難以分離培養(yǎng),形態(tài)特殊且病毒數(shù)量較多的標本,可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察,是一種快速診斷與鑒定病毒的方法,如輪狀病毒、乙肝病毒。
病毒感染后通常誘發(fā)針對病毒一種或多種抗原免疫應答,特異性抗體效價升高或lgM抗體出現(xiàn)有輔助臨床診斷的價值。
(一)補體結(jié)合試驗(CF) CF分二個階段:1.抗原與抗體(一個為已知,一個為待檢)混合,加入定量補體,若抗原與抗體相對應,則補體被消耗;2.在上述混合物中加入溶血素致敏的綿羊紅細胞,若補本已與抗原抗體復合物完全結(jié)合,沒有剩補體存在,那么綿羊紅細胞不會溶血,結(jié)果為陽性,說明待檢標本中有特異性存在,出現(xiàn)陽性結(jié)果時血清標本最高稀釋度為抗體的效價。反之為陰性結(jié)果。由于補體結(jié)合抗體產(chǎn)生早,消失快,適于診斷病毒近期感染。(表23-5)。
取血時期 | 血清稀釋倍數(shù)及試驗結(jié)果 | 抗體效價 | ||||||
1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 1:32 | 1:64 | 1:128 | ||
發(fā)病2~3內(nèi)血清 發(fā)病2~3周后血清 | + + | + + | + + | - + | - + | - - | - - | 1:8 1:32* |
*此例的抗體效價升高4倍,有診斷意義。
(二)中和試驗(NT)在活體或活細胞內(nèi)測定病毒被特異性抗體中和、而失去致病力的試驗。試驗時:①須先測出病毒的半數(shù)致死量(LD50)或半數(shù)感染量(ID50);②隨即取活病毒與被試血清按不同比例混合,放置1~2小時讓其充分中和;③將病毒與血清混合液注入各組動物、雞胚或組織細胞培養(yǎng)管內(nèi)培養(yǎng);④根據(jù)動物、雞胚死亡數(shù)或細胞病變的管數(shù),計算出百分比(%),然后再計算這些試驗對象中的半數(shù)免于死亡或免于致病所需要的最少量血清(或最大量的病毒),就是該血清的中和抗體效價(稱為50%終點的中和效價)。診斷病毒性疾病時,須取病人雙份血清同時做對比試驗,病后血清的中和抗體效價也必須超過病初血清4倍以上,才能確診(表23-6)。用此法鑒定病毒時,須將病毒分別與免疫血清及血清正常血清(對照)混合做對比試驗,免疫血清比正常血清多中和50~100倍劑量的病毒,才能斷定是該病毒。、
表23-6 病人雙份血清的病毒中和試驗結(jié)果(組織細胞培養(yǎng)的中和試驗)
試驗病毒(用100個TCLD50)① | 病人血清(取血時期) | 活病毒+稀釋血清對細胞致、 | 50%終點血清中和抗體效價③ (血清稀釋倍數(shù)) | |||||
1:5 | 1:10 | 1:20 | 1:40 | 1:80 | 1:160 | |||
甲病毒 | 病初(2日) | 0000 | 00++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | 10(1:10) |
病后(20日) | 0000 | 0000 | 0000 | 0000 | 00++ | ++++ | 80(1:80 |
說明:①TCID50=組織培養(yǎng)半數(shù)感染劑量。
②每種稀釋度接種4支組織細胞培養(yǎng)管;0=未出現(xiàn)細胞致病作用;+=出現(xiàn)細胞致病作用。
③此例的病后血清中和抗體效價比病初血清增高8倍,有診斷意義。
病毒中和抗體的特異性高,持續(xù)時間久,以往受顯性或隱性感染后,血中可長期存在中和抗體,所以適用于流行病學調(diào)查或人群免疫水平研究,但因試驗方法繁雜,耗用動物、雞胚或細胞培養(yǎng)較多,故一般不作常規(guī)使用。
(三)血凝抑制試驗(Hemagglutinationinhibition test,HIT)某些病毒(流感病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒、腦炎病毒等)能凝集紅細胞,而抗體與這些病毒結(jié)合后卻能阻止它們的凝集,若雙份血清有≥4倍以上滴度增高,也可用于診斷這類病毒感染。本法簡便、快速、經(jīng)濟、特異性高,常用于流行病學調(diào)查等。
(四)lgM捕捉ELISA 特異性lgM出現(xiàn)于病毒感染的早期或病毒感染的活動期,因此可從急性期病人單份血清中檢出特異性lgM,這是病毒感染實驗室早期診斷的可靠方法。實驗中先用u鏈血清包被微培板孔,用以捕捉血清標本中的lgM類抗體,再加入特異性病毒抗原及酶標抗體以證實特異性lgM的存在,F(xiàn)已廣泛用于病毒病的早期診斷。在先天性感染中,lgM檢測有特殊意義,因lgM不能通過胎盤,新生兒血清中發(fā)現(xiàn)抗病毒lgM提示為宮內(nèi)感染。