免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第二節(jié)　熒光抗體技術(shù)

一、熒光抗體的制備

（一)抗體的熒光素標(biāo)記

用于標(biāo)記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應(yīng)含有針對(duì)標(biāo)本中正常組織的抗體。一般需經(jīng)純化提取IgG后再作標(biāo)記。作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求：①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)健的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。②熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。③熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明。④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。⑤標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒。⑥與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。

常用的標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法有攪拌法和透析法兩種。以FITC標(biāo)記為例，攪拌標(biāo)記法為：先將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液用0.5ml/LpH9.0的碳酸鹽緩沖液平衡，隨后在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液，在室溫持續(xù)攪拌4～6h后，離心，上清即為標(biāo)記物。此法適用于標(biāo)記體積較大，蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記時(shí)間短，熒光素用量少。但本法的影響因素多，若操作不當(dāng)會(huì)引起較臺(tái)強(qiáng)的非特異性熒光染色。

透析法適用于標(biāo)記樣品量少，蛋白含量低的抗體溶液。此法標(biāo)記比較均勻，非特異染色也較低。方法為：先將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，置于含F(xiàn)ITC的0.01mol/LpH9.4碳酸鹽緩沖液中反應(yīng)過(guò)夜，以后再對(duì)PBS透析法去除游離色素。低速離心，取上清。

標(biāo)記完成后，還應(yīng)對(duì)標(biāo)記抗體進(jìn)一步純化以去除未結(jié)合的游離熒光素和過(guò)多結(jié)合熒光素的抗體。純化方法可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。

（二)熒光抗體的鑒定

熒光抗體在使用前應(yīng)加以鑒定。鑒定指標(biāo)記包括效價(jià)及熒光素與蛋白質(zhì)的結(jié)合比率�？贵w效價(jià)可以用瓊脂雙擴(kuò)散法進(jìn)行滴定，效價(jià)大于1:16者較為理想。熒光素與蛋白質(zhì)結(jié)合比率（F/P)的測(cè)定和計(jì)算的基本方法是：將制備的熒光抗體稀釋至A₂₈₀1≈1.0，分別測(cè)讀A₂₈₀（蛋白質(zhì)特異吸收峰)和標(biāo)記熒光素jfsoft.net.cn/wsj/的特異吸收峰，按公式計(jì)算。

F/P值越高，說(shuō)明抗體分子上結(jié)合的熒光素越多，反之則越少。一般用于固定標(biāo)本的熒光抗體以F/P＝1.5為宜，用于活細(xì)胞染色的以F/P＝2.4為宜。

抗體工作濃度的確定方法類似ELISA間接法中酶標(biāo)抗體的滴定。將熒光抗體自1:4～1:256倍比稀釋，對(duì)切片標(biāo)本作熒光抗體染色。以能清晰顯示特異熒光、且非特異染色弱的最高稀釋度為熒光抗體工作濃度。

熒光抗體的保存應(yīng)注意防止抗體失活和防止熒光猝滅。最好小量分裝，－20℃凍存，這樣就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。

二、免疫熒光顯微技術(shù)

免疫熒顯微技術(shù)的基本原理是：使熒光抗體與標(biāo)本切片中組織或細(xì)胞表面的抗原進(jìn)行反應(yīng)，洗滌除去游離的熒光抗體后，于熒光顯微鏡下觀察，在黑暗背景上可見明亮的特異熒光。

（一)標(biāo)本的制作

熒光顯微技術(shù)主要靠觀察切片標(biāo)本上熒光抗體的染色結(jié)果作為抗原的鑒定和定位。因此標(biāo)本制作的好壞直接影響到檢測(cè)的結(jié)果。在制作標(biāo)本過(guò)程中應(yīng)力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和封埋過(guò)程中不發(fā)生溶解和變性，也不擴(kuò)散至臨近細(xì)胞或組織間隙中去。標(biāo)本切片要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。標(biāo)本中干擾抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)要充分洗去，有傳染性的標(biāo)本要注意安全。

常見的臨床標(biāo)本主要有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類。按不同標(biāo)本可制作涂片、印片或切片。組織材料可制備成石蠟切片或冷凍切片。石蠟切片因操作煩瑣，結(jié)果不穩(wěn)定，非特異反應(yīng)強(qiáng)等已少應(yīng)用。組織標(biāo)本也可制成印片，方法是用洗凈的玻片輕壓組織切面，使玻片粘上1～2層組織細(xì)胞。細(xì)胞或細(xì)菌可制成涂片，涂片應(yīng)薄而均勻。涂片或印片制成后應(yīng)迅速吹干、封裝。置－10℃保存或立即使用。

（二)熒光抗體染色

于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體。置濕盒內(nèi)，在一定溫度下溫育一定時(shí)間，一般可用25～37℃30min，不耐熱抗原的檢測(cè)則以4℃過(guò)夜為宜。用PBS充分洗滌，干燥。

（三)熒光顯微鏡檢查

經(jīng)熒光抗體染色的標(biāo)本，需要在熒光顯微鏡下觀察。最好在染色當(dāng)天即作鏡檢，以防熒光消退，影響結(jié)果。

熒光顯微鏡檢查應(yīng)在通風(fēng)良好的暗室內(nèi)進(jìn)行。首先要選擇好光源或?yàn)V光片。濾光片的正確選擇是獲得良好熒光觀察效果的重jfsoft.net.cn/job/要條件。在光源前面的一組激發(fā)濾光片，其作用是提供合適的激發(fā)光。激發(fā)濾光片有兩種。MG為紫外光濾片，只允許波長(zhǎng)275～400nm的紫外光通過(guò)，最大透光度在365nm；BG為藍(lán)紫外光濾片，只允許波長(zhǎng)325～500nm的藍(lán)外光通過(guò)，最大透光度為410nm�？拷�目鏡的一組阻擋濾光片（又稱吸收濾光片或抑制濾光片)的作用是濾除激發(fā)光，只允許熒光通過(guò)。透光范圍為410～650nm，代號(hào)有OG（橙黃色)和GG（淡綠黃色)兩種。觀察FITC標(biāo)記物可選用激發(fā)濾光片BG12，配以吸收濾光片OG4或GG9。觀察RB200標(biāo)記物時(shí)，可選用BG12與OG5配合。

（四)實(shí)驗(yàn)的類型

1．直接法用特異熒光抗體直接滴加于標(biāo)本上，使之與抗原發(fā)生特異性結(jié)合（圖17-1)。本法操作簡(jiǎn)便，特異性高，非特異熒光染色因素少；缺點(diǎn)是敏感度偏低，每檢查一種抗原需制備相應(yīng)的特異熒光抗體。

圖17-1 直接免疫熒光法原理示意圖

2．間接法可用于檢測(cè)抗原和抗體，原理見圖17-2。本法有兩種抗體相繼作用，第一抗體為針對(duì)抗原的特異抗體，第二抗體（熒光抗體)為針對(duì)第一抗體的抗抗體。本法靈敏度高，而且在不同抗原的檢測(cè)中只需應(yīng)用一種熒光抗體。

圖17-2 間接免疫熒光法原理示意圖

圖17-3 補(bǔ)體結(jié)合免疫熒光法原理示意圖

3．補(bǔ)體結(jié)合法本法是間接法的第一步抗原抗體反應(yīng)時(shí)加入補(bǔ)體（多用豚鼠補(bǔ)體)，再用熒光標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體進(jìn)行示蹤（圖17-3)。本法敏感度高，且只需一種抗體。但易出現(xiàn)非特異性染色，加之補(bǔ)體不穩(wěn)定，每次需采新鮮豚鼠血清，操作復(fù)雜。因此較少應(yīng)用。

4．標(biāo)記法本法用FITC及羅丹明分別標(biāo)記不同的抗體，而對(duì)同一標(biāo)本作熒光染色。在有兩種相應(yīng)抗原存在時(shí)，可同時(shí)見到橙紅和黃綠兩種熒光色澤。

三、在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用

熒光抗體技術(shù)在臨床檢驗(yàn)上已用作細(xì)菌、病毒和寄生蟲的檢驗(yàn)及自身免疫病的診斷等。在細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)中主要用于菌種的鑒定。標(biāo)本材料可以是培養(yǎng)物、感染組織、病人分泌排泄物等。本法較其他鑒定細(xì)菌的血清學(xué)方法速度快、操作簡(jiǎn)單、敏感性高，但在細(xì)菌實(shí)驗(yàn)診斷中，一般只能作為一種補(bǔ)充手段使用，而不能代替常規(guī)診斷。熒光抗體染色法對(duì)腦膜炎奈氏菌、痢疾志賀菌、霍亂弧菌、布氏桿菌和炭疽桿菌等的實(shí)驗(yàn)診斷有較好效果。熒光間接染色法測(cè)定血清中的抗體，可用于流行病學(xué)調(diào)查和臨床回顧診斷。免疫熒光用于梅毒螺旋體抗體的檢測(cè)是梅毒特異性診斷常用方法之一。免疫熒光技術(shù)在病毒學(xué)檢驗(yàn)中有重要意義，因?yàn)槠胀ü鈱W(xué)顯微鏡看不到病毒，用熒光抗體染色法可檢出病毒及其繁殖情況。

在寄生蟲感染診斷中，間接熒光抗體染色法有非常廣泛的應(yīng)用。間接免疫熒光試驗(yàn)（IFAT)是當(dāng)前公認(rèn)的最有效的檢測(cè)瘧疾抗體的方法。常用抗原為瘧疾患者血液中紅內(nèi)期裂殖體抗原。IFAT對(duì)腸外阿米巴、尤其是阿米巴肝膿腫也有很高的診斷價(jià)值，所用抗原是阿米巴培養(yǎng)物懸液或提取的可溶性抗原。

免疫熒光法還是檢測(cè)自身抗體的好工具，在自身免疫病的實(shí)驗(yàn)診斷中應(yīng)用廣泛。其突出優(yōu)點(diǎn)是能以簡(jiǎn)單方法同時(shí)檢測(cè)抗體和與抗體起特異反應(yīng)的組織成分，并能在同一組織中同時(shí)檢查抗不同組織成分的抗體。主要有抗核抗體、抗平滑肌抗體和抗線粒體抗體等�？购丝贵w的檢測(cè)最常采用鼠肝作核抗原，可做成冰凍切片、印片或勻漿。用組織培養(yǎng)細(xì)胞如Hep-2細(xì)胞或Hela細(xì)胞涂片還可檢出抗著絲點(diǎn)抗體、抗中性粒細(xì)胞漿抗體等。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)可以檢出的其他自身抗體有抗（胃)壁細(xì)胞抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗甲狀腺球蛋白抗體、抗甲狀腺微粒體抗體、抗骨髓肌抗體及抗腎上腺抗體等。

熒光抗體技術(shù)的一種特殊應(yīng)用是流式細(xì)胞分析（flowcytometry)。在這種分析方法中檢測(cè)儀器不是熒光顯微鏡，檢測(cè)對(duì)象不是固定了的標(biāo)本，而是將游離細(xì)胞作熒光抗體特異染色后，在特殊設(shè)計(jì)的儀器中通過(guò)噴嘴逐個(gè)流出，經(jīng)單色激光照射發(fā)出的熒光信號(hào)由熒光檢測(cè)計(jì)檢測(cè)，并自動(dòng)處理各處數(shù)據(jù)。這種方法可用于檢測(cè)細(xì)胞大小、折散率、粘滯度等，更常用于T細(xì)胞亞群等的檢測(cè)。