流式細(xì)胞術(shù)對外周血白細(xì)胞的免疫熒光分析

　　2．艾滋病以及HLTV—III感染艾滋病是一種由人類T淋巴細(xì)胞病毒（HLTV--III)感染而造成的疾病。這種病毒主要侵襲CD₄⁺T細(xì)胞，而導(dǎo)致CD₄淋巴細(xì)胞減少，CD₄/CD₈淋巴細(xì)胞比值下降，甚至可低到0.5以下。艾滋病多發(fā)生在同性戀性行為活躍的男性，這可能與多次重復(fù)感染HLTV-III有關(guān)。對異性性行為活躍的人來講，對HLTV—IIi 感染的機會也不容忽視。另一種感染的途徑是HLTV血清陽性的獻(xiàn)血者對受血者的感染。有部分人血液中T淋巴細(xì)胞減少，CD₄/CD₈比值下降，但HTLV血清反應(yīng)不一定就是陽性。有些人CD₄減少不明顯，但CD₈有所增加，也會導(dǎo)致CD₄/CD₈的的比值下降。

　　對可疑為艾滋病及血清檢驗為陽性的人，T細(xì)胞亞群是分析了解免疫系統(tǒng)被病毒破壞程度的標(biāo)志。初診時，CD₄細(xì)胞越少，CD₄/CD₈值越低者，預(yù)后越差。所以經(jīng)治療后恢復(fù)的指標(biāo)則是CD₄細(xì)胞數(shù)增加，CD₄/CD₈比值升高。用熒光標(biāo)記雙染色的FCM分析的結(jié)果表明，艾滋病人除CD₄和CD₈的改變外，同時還可以表現(xiàn)出OKT₁₀陽性細(xì)胞增多（圖10-15)。病人表現(xiàn)為CD₈和OKT₁₀同時增加時，預(yù)后比OKT₁₀陽性細(xì)胞低的病情嚴(yán)重。

圖10-15　健康人艾滋病人淋巴細(xì)胞表面抗原的比較

艾滋病人Leu₃⁺、Leu₈^-和Leu₃⁺、Leu₈⁺細(xì)胞均減少，而Leu₂⁺、Leu₈^-細(xì)胞相應(yīng)增加，

Leu₂⁺、Leu₇⁺與Leu2₃⁺、Leu₁₀⁺細(xì)胞明顯增加

　　3．白血病和淋巴瘤的表現(xiàn)型　近年來，為了弄清這些腫瘤的病理組織形態(tài)、影響治療效果的原因與免疫狀態(tài)的相互關(guān)系，對于不同類型的白血病和淋巴瘤作為廣泛的細(xì)胞表面表現(xiàn)型的研究。

　　在診斷方面，F(xiàn)CM與單克隆抗體結(jié)合，可以弄清這些腫瘤的免疫起源，特別是分清B細(xì)胞性、T細(xì)胞性或骨髓性腫瘤。同時，還可以證實一些與細(xì)胞起源相關(guān)的抗原，如普通急性淋巴細(xì)胞性白血病抗原（CALLA、CD₁₀)。另外，可以用適當(dāng)?shù)脑噭�從反�?yīng)免疫過程中來證實單克隆的腫瘤細(xì)胞的增殖。

　　大部分淋巴系統(tǒng)腫瘤均起源于B細(xì)胞。而B細(xì)胞腫瘤常用抗免疫球蛋白的抗體來證實。由于前B細(xì)胞與漿細(xì)胞表面均無免疫蛋白，所以用檢測免疫球蛋白的辦法就只能證實B細(xì)胞發(fā)育中間時期的腫瘤。目前，已有一系列的B細(xì)胞表面抗原被發(fā)現(xiàn)，而可以證實B細(xì)胞個體發(fā)育的各個時期的腫瘤。

　　對B細(xì)胞腫瘤最有價值的抗原是CALLA。這種抗原僅存在于B細(xì)胞正常以育期的前B細(xì)胞、早期B細(xì)胞以及80%～90%的急性淋巴細(xì)胞性白血病。因此，抗CALLA抗體可以區(qū)別淋巴細(xì)胞性和髓性白血病。用抗CALLA結(jié)合其它一些成熟B細(xì)胞的單克隆抗體，如CD₁₉，CD₂₀，CD₂₄（B₄，B₁，BA_-1)將能證實大部分B細(xì)胞來源的腫瘤。圖10-16給出了B細(xì)胞分化的各個時期細(xì)胞膜的表現(xiàn)型。來源于B細(xì)胞的腫瘤和正常B細(xì)胞的表現(xiàn)型相似，也就是說，B細(xì)胞前身、成熟B細(xì)胞及最后分化為分泌B細(xì)胞—漿細(xì)胞。

圖10-16　B細(xì)胞分化各時期的細(xì)胞膜表現(xiàn)型

　　由于T淋巴細(xì)胞來源的腫瘤浸潤性較強，預(yù)后較差，并需要多種治療。T細(xì)胞腫瘤的表現(xiàn)型千變?nèi)f化，但大部分均表現(xiàn)T細(xì)胞抗原CD₇（Leu₉,3A)或其它T細(xì)胞抗原CD₂、CD₅（OKT₁₁，OKT₁)。這些抗原與腫瘤的細(xì)胞成熟時間有關(guān)，因而有助于擬定治療方案。從FCM分析的結(jié)果表明，非成熟的T細(xì)胞腫瘤常表現(xiàn)非成熟的T細(xì)胞抗原，如CD₁和t ₁₀。而成熟的T 細(xì)胞腫瘤則僅表現(xiàn)成熟T細(xì)胞抗原：CD₂、CD₃、CD₅和CD₇。有時也可表現(xiàn)CD₂、CD₈，但不會出現(xiàn)在同一個細(xì)胞上面。

　　由于腫瘤細(xì)胞的多種來源，很難避免在腫瘤標(biāo)本中混雜正常細(xì)胞，這給FCM的分析帶來技術(shù)上的困難。如殘留的紅細(xì)胞在FCM分析時，落入淋巴細(xì)胞框定的范圍內(nèi)而造成淋巴細(xì)胞各種亞群百分率下降。所以在制備標(biāo)本時，應(yīng)盡量想法去除紅細(xì)胞。另一種污染是正常細(xì)胞存在于腫瘤細(xì)胞之間，這是一個很頭痛的問題。例如骨髓常被外周血污染，反應(yīng)性的正常淋巴細(xì)胞滲入到腫瘤組織中等，因此估計污染程度對解釋FCM分析的資料有一定的意義。因為在FCM分析時，正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞可能由于不同的體積和密度而被分開，根據(jù)對污染的估計，仔細(xì)分析圖像就能得到比較正確的結(jié)果。

　　4．FCM對正常B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤分析　　FCM對正常B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤的分析在免疫學(xué)研究和臨床診斷上有著重要的實用價值，B細(xì)胞的某些特征必須使用FCM來分析，但是這在FCM技術(shù)方法中仍存在著一些需要解決的問題。

　�。�1)B細(xì)胞的標(biāo)記：B細(xì)胞膜表現(xiàn)免疫球蛋白（SIg)存在于所有成熟B細(xì)胞。最早的B細(xì)胞前身，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有免疫球蛋白M（IgM)，但不存在于細(xì)胞膜表面。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IgM的證實以及同時測定細(xì)胞表面的SIg，對FCM是很困難的，當(dāng)然今后可能會用雙染法來解決這樣的難題。大部分成熟B細(xì)胞具有SIgM和SIgD，少量具有SIgG和SIgA，當(dāng)然這也可能是因為不同的亞群的緣故。但僅以Ig的重鏈來分類B細(xì)胞是不可靠的，因為B細(xì)胞可以從膜表面的IgM逐漸轉(zhuǎn)變成IgG，因而從重鏈著手無法把B細(xì)胞分類。大部分B細(xì)胞腫瘤也表現(xiàn)出帶有SIgM和SigD。隨著B細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變成漿細(xì)胞，膜表面Ig 逐漸喪失，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)又出現(xiàn)大量的免疫球蛋白。

　　與重鏈相反，B細(xì)胞的整個發(fā)生期只有一種k或者λ輕鏈，B細(xì)胞腫瘤克隆僅表現(xiàn)一種輕鏈，因此通過在FCM上顯示的不平衡的輕鏈表現(xiàn)可以確定B細(xì)胞腫瘤。測定方法見（3)。

　　用SIg的最大缺點是它的“嗜細(xì)胞性”，因為正常B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK)、激活T細(xì)胞以及所有巨噬細(xì)胞均有Fc段受體，因而可以不同程度地與抗SIg單克隆抗體的Fc段結(jié)合而產(chǎn)生非特異性的結(jié)果，因此選擇抗體時，應(yīng)使用已被胃蛋白酶消化過的、Fc段也被去除的、僅留下來的F（ab’)₂。

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