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醫(yī)學微生物學:第三節(jié) 丙型肝炎病毒

1974年Golafield 首先報告輸血后非甲非乙型肝炎。1989年Choc等應用分子克隆技術(shù)獲得本病毒基因克隆,并命名本病及其病毒為丙型肝炎(HepatitisC)和丙型肝炎病毒(HCV)。由于HCV基因組在結(jié)構(gòu)和表型特征上與人黃病毒和瘟病毒相類似,將其歸為黃病毒科HCV。一、生物學特性…

1974年Golafield 首先報告輸血后非甲非乙型肝炎。1989年Choc等應用分子克隆技術(shù)獲得本病毒基因克隆,并命名本病及其病毒為丙型肝炎(HepatitisC)和丙型肝炎病毒(HCV)。由于HCV基因組在結(jié)構(gòu)和表型特征上與人黃病毒和瘟病毒相類似,將其歸為黃病毒科HCV。

一、生物學特性

(一)形態(tài)培養(yǎng)

HCV病毒體呈球形,直徑小于80nm(在肝細胞中為36~40nm,在血液中為36-62nm),為單股正鏈RNA病毒,在核衣殼外包繞含脂質(zhì)的囊膜,囊膜上有剌突。HCV體外培養(yǎng)尚未找到敏感有效的細胞培養(yǎng)系統(tǒng),但黑猩猩對HCV很敏感。

(二)基因結(jié)構(gòu):

HCV-RNA大約有9500-10000bp組成,5′3′非編碼區(qū)(NCR)分別有319-341bp,和27-55bp,含有幾個順向和反向重復序列,可能與基因復制有關(guān)。在5′非編碼區(qū)下游緊接一開放的閱讀框(ORF),其中基因組排列順序為5"-C-E1-E2/NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-3",能編碼一長3014個氨基酸的多聚蛋白前體,可經(jīng)宿主細胞和病毒自身蛋白酶作用后,裂解成各自獨立病毒蛋白,即三種結(jié)構(gòu)蛋白,為分子量19KD的核衣殼蛋白(或稱核心蛋白,C)和33KD(E1),72Kd(E2/NS1)的糖蛋白,及四種分子量為23KD、52KD、60KD、116KD的非結(jié)構(gòu)蛋白分別與NS2、NS3、NS4、NS5相對應。由于GP72正好與瘟病毒表面蛋白或黃病毒第一個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)相對應,故將GP72的基因標記稱謂E2/NS1。E1和E2/NS1糖蛋白能產(chǎn)生抗HCV的中和作用。NS2和NS4的功能還不清楚,發(fā)現(xiàn)與細胞膜緊密結(jié)合在一起。NS3蛋白具有螺旋酶活性,參與解旋HCV-RNA分子,以協(xié)助RNA復制,NS5有依賴于RNA的聚合酶活性,參與HCV基因組復制。

(三)變異性:

HCV具有顯著異源性和高度可變性,對已知全部基因組序列的HCV株進行分析比較其核苷酸和氨基酸序列存在較大差異。并表現(xiàn)HCV基因組各部位的變異程度不相一致,如5′—CR最保守,同源性在92-100%,而3′NCR區(qū)變異程度較高,在HCV的編碼基因中,C區(qū)最保守、非結(jié)構(gòu)(NS)區(qū)次之,編碼囊膜蛋白E2/NS1可變性最高稱為高可變區(qū)。

(四)基因分型:

HCV基因分型還無統(tǒng)一標準,因用于基因分型的部位和采用的技術(shù)方法不同,出現(xiàn)了各種基因分型結(jié)果,但各種基因型分類方法之間有一定的對應關(guān)系,茲舉幾種基因型分類法供參考(表26-2)。

表26-2 HCV基因型各種分型之間的對應關(guān)系

Simmonds
1a1b2a2b3a3b4a5a6a
Okamoto
Enomoto
Mori
Cha

PT

GⅠ

K1

GⅡ

K2a

GⅢ

K2b

GⅣ

K3

GⅣ
K3

GⅣ
 
GⅤ

現(xiàn)知歐美國家多數(shù)HCV-Ⅰ型感染,而亞洲國家以Ⅱ型為主,Ⅲ型次之。Okomoto報告日本慢性丙型肝炎患者和健康獻血員主要為Ⅱ型感染,分別占59.3%和82.4%,而血友病人約50%為Ⅰ型感染,原因是應用輸入美國進口凝因子Ⅷ。Wang氏報告我國北京慢性丙型肝炎患者86.2%為Ⅱ型感染,Ⅲ型感染為13.8%。而新疆病人Ⅲ型感染卻占50%,說明不同型HCV具有一定的地區(qū)和人群分布特征。此外不同基因型感染引起臨床過程和干擾素治療反應亦表現(xiàn)不同,如Ⅲ型感染臨床癥狀較重,有引起嚴懲肝病傾向:Ⅱ型(Simmonds 1b)感染對干擾素治療不敏感效果差。Ⅲ型感染(Simononds 2a)用干擾素治療效果好。

二、致病性與免疫性

丙型肝炎的傳染源主要為急性臨床型和無癥狀的亞臨床病人,慢性病人和病毒攜帶者。一般病人發(fā)病前12天,其血液即有感染性,并可帶毒12年以上。HCV主要血源傳播,國外30-90%輸血后肝炎為丙型肝炎,我國輸血后肝炎中丙型肝炎占1/3。此外還可通過其他方式如母嬰垂直傳播,家庭日常接觸和性傳播等。

輸入含HCV或HCV-RNA的血漿或血液制品,一般經(jīng)6-7周潛伏期例急性發(fā)病,臨床表現(xiàn)全身無力,胃納差,肝區(qū)不適,1/3病人有黃疸,ALT升高,抗HCV抗體陽性。臨床丙型肝炎病人50%可發(fā)展為慢性肝炎,甚至部分病人會導致肝硬及肝細胞癌。其余約半數(shù)病人為自限性,可自動康復。

丙型肝炎發(fā)病機理仍未十分清楚,當HCV在肝細胞內(nèi)復制引起肝細胞結(jié)構(gòu)和功能改變或干擾肝細胞蛋白合成,可造成肝細胞變性壞死,表明HCV直接損害肝臟,導致發(fā)病起一定作用。但多數(shù)學者認為細胞免疫病理反應可能起重要作用,發(fā)現(xiàn)丙型肝炎與乙型肝炎一樣,其組織浸潤細胞以CD3+為主,細胞毒T細胞(TC)特異攻擊HCV感染的靶細胞,可引起肝細胞損傷。

臨床觀察資料表明,人感染HCV后所產(chǎn)生的保護性免疫力很差,能再感染不同,甚至部分病人會導致肝硬化及肝細胞癌。其余約半數(shù)病人為自限性,可自動康復。

丙型肝炎發(fā)病機理目前仍未十分清楚,當HCV在肝細胞內(nèi)復制引起肝細胞結(jié)構(gòu)和功能改變或干擾肝細胞蛋白合成,可造成肝細胞變性壞死,表明HCV直接損害肝臟,導致發(fā)病起一定作用。但多數(shù)學認為細胞免疫病理反應可能起重要作用,發(fā)現(xiàn)丙型肝炎與乙型肝炎一樣,其組織浸潤細胞以CD3+為主,細胞毒T細胞(TC)特異攻擊HCV感染的靶細胞,可引起肝細胞損傷。

臨床觀察資料表明,人感染HCV后所產(chǎn)生的保護性免疫力很差,能再感染不同株,甚至同株HCV?赡芘cHCV感染后病毒血癥水平低及HDV基因級變異性有關(guān)。

三、微生物學診斷

放射免疫診斷(RIA)或酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)檢測血清中抗HCV

1989年,Kuo等建立了抗-C-100放射免疫試驗方法(RIA),隨后Ortho公司又研制成功酶聯(lián)免疫試驗方法(ELISA)檢測抗-C-100。這兩種方法均用重組酵母表達的病毒抗原(C-100-3,為NS4編碼的蛋白,含363個氨基酸),經(jīng)純化后包被微量塑料板孔,然后加被檢血清,該病毒抗原即與被檢血清中抗-C-100結(jié)合,最后加同位素或酶標記的鼠抗人lgG單克隆抗體,加底物顯色判斷結(jié)果。

用上述酶聯(lián)免疫試驗法(ELISA)檢測抗-C-100有如下缺點:1. 抗-C-100出現(xiàn)較晚,約半數(shù)輸血后丙型肝炎病人于輸血后4~6個月抗—C-100首次陽轉(zhuǎn),因此,不宜作為急性丙型肝炎的常規(guī)實驗室診斷;2.抗-C-100不是中和抗體,也不是lgM抗體,而是lgG 抗體; 3.本法不夠靈敏,少數(shù)丙型肝炎病人檢測不到抗-C-100;4.有非特異性,一些自家免疫性慢性肝病患者可出現(xiàn)假陽性,因此,抗HCV陽性需作重組免疫印跡試驗(Recombinant Immune BlotAssay, RIBA, 或稱 Western Blot)證實。

由于HCV核心抗體出現(xiàn)較早,因此,最近美國第二代酶聯(lián)免疫試驗法(ELISA)檢測抗HCV。該試劑盒采用HCVC區(qū)編碼蛋白C-22-3和非結(jié)構(gòu)區(qū)NS3編碼蛋白C-33-3和C-100-3包被載體。用本法檢測抗HCV,其檢出率可提高25~30%,且檢出抗HDV的時間也可提早16~42天。

(二)HDV cDNA/聚合酶鏈反應(HCV cDNA/Polymerase Chain Reaction,RTPCR)測定肝和血清中HCV RNA。

本法是將HDV RNA逆轉(zhuǎn)錄為HCV DNA,選用高度保守的5′非編碼區(qū)引物擴增放大后作電泳觀察結(jié)果。本法較靈敏。由于肝和血清中HCv RNA出現(xiàn)較抗-HCV為早,一些HCV感染者抗HCV尚未陽轉(zhuǎn)時,其肝和血清中已可測到HDv RNA。HCV RNA陽性,說明病毒在體內(nèi)復制;HCV RNA陰轉(zhuǎn),說明病毒被清除。因此,RT-PCR可作為丙型肝炎的早期診斷和獻血員篩查的出現(xiàn)指標,也可作為丙型肝炎預后的一個指標。

(三)免疫組化法檢測肝組織中HCV抗原

感染HCV的黑猩猩或病人血清中提取lgG,用間接免疫熒光或間接免疫酶組化法檢測肝內(nèi)HCV抗原。

四、防治原則

丙型肝炎的預防方法基本與乙型肝炎的相同。目前,我國預防丙型肝炎的重點應放在對獻血員的管理,加強消毒隔離制度,防止醫(yī)源性傳播。

國外報告,對獻血員進行抗HCV篩查,可排除85%具有HCV傳染性的獻血員,從而明顯降低輸血后丙型肝炎的發(fā)病率。由于獻血員抗HCV陽性率與ALT水平和抗-HBc是否陽性有關(guān),ALT(丙氨酸轉(zhuǎn)移酶)異常和抗HBc陽性者抗HCV陽性率明顯高于ALT正常和抗HBc陰性者(44%jfsoft.net.cn/pharm/:0.5%),因此,在目前尚無條件進行抗HCV篩查的地區(qū),可對獻血員作ALT和抗HBc篩查。據(jù)報道,排除ALT異常的獻血員后,輸血后丙型肝炎發(fā)病率可下降47.4%;排除抗HBc陽性的獻血員后,輸血后丙型肝炎發(fā)病率下降33%;如上述兩項指標異常的獻血員均被排除,則輸血后丙型肝炎發(fā)病率可下降61.2%。

最近,美國疾病控制中心報告,經(jīng)皮膚感染丙型肝炎病人血液者,于暴露后立即注射免疫蛋白(0.06ml/kg)可能有預防作用。

本病的最終控制將取決于疫苗預防。HCV分子克隆的成功,為本病的疫苗預防提供了可能性,未來的丙型肝炎疫苗應包括各種不同重組的HCV毒株,或根據(jù)各地流行的HCV毒株來構(gòu)建丙型肝炎疫苗。

干擾素治療丙型肝炎,可緩解病情,防止約1/2急性丙型肝www.med126.com炎向慢性化發(fā)展,慢性丙型肝炎用IFN治療后有效率為50%,但有半數(shù)復發(fā),維持有效率為20-25%。

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