一、樣品處理
DNA是染色體的主要組成部分，是PCR的擴(kuò)增模板。要進(jìn)行PCR，研究DNA結(jié)構(gòu)與功能或者用于診斷目的，首先必須從生物體內(nèi)提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在，其分子量大（人的染色體DNA平均大小為3.0×109bp)，提取DNA應(yīng)盡量保持DNA完整性和純度，即在提取中盡量避免機(jī)械張力引起的DNA分子降解，又要注意雜質(zhì)及蛋白的去除，防止胞內(nèi)酶解DNA。因此，提取DNA的基本過程是：用Proteinase K及SDS，在EDTA存在下，裂解細(xì)胞，消化蛋白質(zhì)，使核蛋白解聚及胞內(nèi)DNA酶失活，然后用酚/氯仿多次提取去除蛋白質(zhì)，在DNA中若混有少量RNA，可用RNase去除，最后用乙醇沉淀得到DNA。
理論上PCR對(duì)模板DNA純度及完整性要求并不高，細(xì)胞經(jīng)過熱變性使DNA釋出就可以作為模板，依賴引物的選擇性進(jìn)行擴(kuò)增。這對(duì)拷貝數(shù)很多的基因組，確實(shí)如此。但當(dāng)待擴(kuò)增的拷貝數(shù)甚少而無關(guān)細(xì)胞甚多時(shí)則擴(kuò)增就不易成功，其原因是：①非希望的擴(kuò)增增多，掩蓋了所需擴(kuò)增的片段，使其數(shù)量減少至不能檢測(cè)到的程度。②生物樣品中的雜質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)，最主要的是血液和瓊脂糖。例如在100μl反應(yīng)液中加入1μl全血就可引起抑制，0.8μmol/L的血紅素也會(huì)引起明顯的抑制。對(duì)于含血液的樣品，可以用滲透壓溶解紅細(xì)胞，離心集取細(xì)胞核，洗除血紅蛋白，再用蛋白酶/表面活性劑處理的方法來解決。另一簡單的方法是煮沸之，使釋放DNA，并沉淀Hb，用上清液作PCR。
現(xiàn)將PCR前處理各種標(biāo)本的基本方法介紹如下：
1．所需溶液
�。�1)PBs 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4 pH7.0
�。�2)含表面活性劑及蛋白酶K的PCR緩沖液
50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2
0.1mg/ml明膠，0.45%NP40,0.45%吐溫20
高壓滅菌，冷凍儲(chǔ)存。臨用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K（水溶液)至100μl溶液中。
�。�3)溶血緩沖液
0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH7.5
5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100
2．提取方法
�。�1)用聚蔗糖-泛影葡胺梯度法從血液或培養(yǎng)細(xì)胞分離的單核細(xì)胞（當(dāng)PBC〈10%細(xì)胞數(shù)時(shí)用此程序)
�、賹⒓�(xì)胞樣品用PBS稀釋至10ml，置15ml錐形離心管中；
②100×g離心2～5min，吸去上清；
�、奂�(xì)胞再懸浮于10ml PBS中重新離心洗滌；
④沉淀物懸浮于溶液2中，使細(xì)胞濃度約為6×106/ml，移至1.5ml管中；
�、�50～60℃保溫1h；
�、�95℃保溫10min使蛋白酶變性；
⑦冷凍儲(chǔ)存。
如果RBC多于細(xì)胞的10%，則用PBS洗1次（步驟1，2)后，懸浮于1ml溶液3，并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，如程序B-2離心1次，再懸浮于溶液2中按程序A-4繼續(xù)進(jìn)行。醫(yī).學(xué).全.在線.網(wǎng).站.提供
（2)全血：此法使胞膜溶解故胞漿DNA丟失，約可得20μg DNA/0.5ml血。
�、�0.5ml全血與0.5ml溶液3共置1.5ml管中；
�、�13000×g離心20s；
�、畚ド锨澹�1ml溶液3，旋渦混合使沉淀重新懸��；
�、苤貜�(fù)第2，3步2次；
⑤13000×g離心2s，吸去上清，懸浮于0.5ml溶液2中；
�、薨闯绦駻5～7步進(jìn)行。
�。�3)拭子
①用PBS預(yù)溫的試子從宮頸、陰道或陰莖采樣；
�、谑米又萌�2ml PBS（含抗霉劑)于15ml離心管中，室溫可保存24h，置4℃可保存更長時(shí)間。也可用旋渦混合器振蕩使細(xì)胞加速游離；
③取去拭子，2000～13000×g離心5min，吸去上清；
④如含RBC則加1ml溶液3，轉(zhuǎn)移至1.5ml E管中，按程序B-2開始進(jìn)行；
�、萑绮缓琑BC則加溶液2，按程序A-4進(jìn)行。
