PCR技術(shù)必須有人工合成的合理引物和提取的樣品DNA，然后才進行自動熱循環(huán)，最后進行產(chǎn)物鑒定與分析。引物設(shè)計與合成目前只能在少數(shù)技術(shù)力量較強的研究院、所進行，臨床應(yīng)用只需購買PCR檢測試劑盒就可開展工作，PCR自動熱循環(huán)中影響因素很多，對不同的DNA樣品，PCR反應(yīng)中各種成份加入量和溫度循環(huán)參數(shù)均不一致�，F(xiàn)將幾種主要影響因素介紹如下。
一、溫度循環(huán)參數(shù)
在PCR自動熱循環(huán)中，最關(guān)鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個循環(huán)，擴增片段500bp。在這里，每一步的時間應(yīng)從反應(yīng)混合液達到所要求的溫度后開始計算。在自動熱循環(huán)儀內(nèi)由混合液原溫度變至所要求溫度的時間需要30～60s，這一遲滯時間的長短取決于幾個因素，包括反應(yīng)管類型、壁厚、反應(yīng)混合液體積、熱源（水浴或加熱塊)以及兩步驟間的溫度差，在設(shè)置熱循環(huán)時應(yīng)充分給以重視和考慮，對每一儀器均應(yīng)進行實測。
關(guān)于熱循環(huán)時間的另一個重要考慮是兩條引物之間的距離；距離越遠(yuǎn)，合成靶序列全長所需的時間也越長，前文給出的反應(yīng)時間是按最適于合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。
1．模板變性溫度變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA解鏈的溫度，達不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不完全，DNA雙鏈會很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取90～95℃。樣品一旦到達此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時間過久沒有必要；反之，在高溫時間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95℃。
2．引物退火溫度退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量；溫度高特異性強，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴增效率下降；溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。也可根據(jù)引物的（G+C)%含量進行推測，把握試驗的起始點，一般試驗中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進行計算：
Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃
其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個數(shù)。例如，20個堿基的引物，如果（G+C)%含量為50%時，則Ta的起點可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時（如0.2μmol/L),退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長時間退火沒有必要。
3．引物延伸溫度溫度的選擇取決于Taq DNA聚合酶的最適溫度。一般取70～75℃，在72℃時酶催化核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)速率可達35～100個核苷酸/秒。每分鐘可延伸1kb的長度，其速度取決于緩沖溶液的組成、pH值、鹽濃度與DNA模板的性質(zhì)。擴增片段如短于150bp，則可省略延伸這一步，而成為雙溫循環(huán)，因Taq DNA聚合酶在退火溫度下足以完成短序列的合成。對于100～300bp之間的短序列片段，采用快速、簡便的雙溫循環(huán)是行之有效的。此時，引物延伸溫度與退火溫度相同。對于1kb以上的DNA片段，可根據(jù)片段長度將延伸時間控制在1～7min，與此同時，在PCR緩沖液中需加入明膠或BSA試劑，使Taq DNA聚合酶在長時間內(nèi)保持良好的活性與穩(wěn)定性；15%～20%的甘油有助于擴增2.5kb左右或較長DNA片段。醫(yī).學(xué) 全,在.線,提供www.med126.com
4．循環(huán)次數(shù)常規(guī)PCR一般為25～40個周期。一般的錯誤是循環(huán)次數(shù)過多，非特異性背景嚴(yán)重，復(fù)雜度增加。當(dāng)然循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)太少，則產(chǎn)率偏低。所以，在保證產(chǎn)物得率前提下，應(yīng)盡量減少循環(huán)次數(shù)。
擴增結(jié)束后，樣品冷卻并置4℃保存。
二、引物引物設(shè)計
要擴增模板DNA，首先要設(shè)計兩條寡核苷酸引物，所謂引物，實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段，兩引物間距離決定擴增片段的長度，兩引物的5’端決定擴增產(chǎn)物的兩個5’末端位置。由此可見，引物是決定PCR擴增片段長度、位置和結(jié)果的關(guān)鍵，引物設(shè)計也就更為重要。
引物設(shè)計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的，兩引物之間的序列未必清楚，這兩段已知序列一般為15～20個堿基，可以用DNA合成儀合成與其對應(yīng)互補的二條引物，除此之外，引物設(shè)計一般遵循的原則包括：
1．引物長度根據(jù)統(tǒng)計學(xué)計算，長約17個堿基的寡核苷酸序列在人的基因組中可能出現(xiàn)的機率的為1次。因此，引物長度一般最低不少于16個核苷酸，而最高不超過30個核苷酸，最佳長度為20～24個核苷酸。這樣短的寡核苷酸在聚合反應(yīng)溫度（通過72℃)下不會形成穩(wěn)定的雜合體。有時可在5’端添加不與模板互補的序列，如限制性酶切位點或啟動因子等，以完成基因克隆和其他特殊需要；引物5’端生物素標(biāo)記或熒光標(biāo)記可用于微生物檢測等各種目的。
有時引物不起作用，理由不明，可移動位置來解決。
2．（G+C)%含量引物的組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體。兩個引物中（G+C)%含量應(yīng)盡量相似，在已知擴增片段（G+C)%含量時宜接近于待擴增片段，一般以40%～60%為佳。
3．引物內(nèi)部應(yīng)避免內(nèi)部形成明顯的次級結(jié)構(gòu)，尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin structures)。例如：
4．引物之間兩個引物之間不應(yīng)發(fā)生互補，特別是在引物3’端，即使無法避免，其3’端互補堿基也不應(yīng)大于2個堿基，否則易生成“引物二聚體”或“引物二倍體”（Primer dimer)。所謂引物二聚體實質(zhì)上是在DNA聚合酶作用下，一條引物在另一條引物序列上進行延伸所形成的與二條引物長度相近的雙鏈DNA片段，是PCR常見的副產(chǎn)品，有時甚至成為主要產(chǎn)物。
另外，兩條引物之間避免有同源序列，尤為連續(xù)6個以上相同堿基的寡核苷酸片段，否則兩條引物會相互競爭模板的同一位點；同樣，引物與待擴增靶DNA或樣品DNA的其它序列也不能存在6個以上堿基的同源序列。否則，引物就會與其它位點結(jié)合，使特異擴增減少，非特異擴增增加。
5．引物3’端配對DNA聚合酶是在引物3’端添加單核苷酸，所以，引物3’端5～6個堿基與靶DNA的配對要求必須精確和嚴(yán)格，這樣才能保證PCR有效擴增。
引物設(shè)計是否合理可用PCRDESN軟件和美國PRIMER軟件進行計算機檢索來核定。
人工合成的寡核苷酸引于最好經(jīng)過色譜（層析)純化或PAGE純化，以除去未能合成至全長的短鏈等雜質(zhì)。純化引物在25%乙腈溶液中4℃保存可阻止微生物的生長；一般情況下，不用的引物應(yīng)保存在-20℃冰箱中，在液體中引物能保存6個月，凍干后可保存1～2年。
