（四)雜交率
傳統(tǒng)雜交率分析主要用于DNA復(fù)性研究，在這種情況下，探針和靶鏈在溶液中的濃度相同。現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進(jìn)行，此外，固相雜交中靶序列不在液相，故其濃度不能精確計(jì)算。因此，本文不討論通常用于雜交反應(yīng)的傳統(tǒng)二級速率公式，而敘述一級動力學(xué)公式。
在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度（復(fù)雜度)和探針濃度。下面列出的公式適用于過剩單鏈探針對靶序列雜交的情形，雙鏈探針開始時(shí)（1～4h)，雜交動力學(xué)相同，但長時(shí)間雜交后，由于探針本身的復(fù)性，可用于雜交的探針濃度會逐漸降低。公式（1)可用于估計(jì)半數(shù)探針與固定靶序列雜交所需的時(shí)間。
t1/2=ln2/kc
t=保溫（雜交)時(shí)間（s)；k =形成雜交體的速率常數(shù)[mol/(Lxntxs)]；c =溶液中的探針濃度（mol/L)。速率常數(shù)K決定于探針長度（L)、探針復(fù)雜度（N)、溫度、離子強(qiáng)度、粘度和pH。不含重復(fù)序列的探針，l =N。例如，對一個含兩個20nt序列的40mer探針而言，l =40，N=20。K與這些變量的關(guān)系為：
Kn= 3.5×105 K=KnL0.5/N (2)
Kn是締結(jié)常數(shù)，Kn =3.5×105 。Na+濃度為0.4～1.0mol/L, Ph5～9和雜交溫度低于探針-靶序列雜交體Tm值2.5℃時(shí)，公式（1)和（2)可合并為（3)，用于計(jì)算半數(shù)探針與靶序列的雜交率（以秒計(jì))。
對一個長500個堿基的探針而言，此值為：
長500個堿基的探針雜交時(shí)間很長（20h)，應(yīng)用短探針和使用雜交促進(jìn)劑有其優(yōu)越性。由于實(shí)際應(yīng)用的探針長度變化較大（對＞1kb的探針，因擴(kuò)散與粘度效應(yīng)不可能使因素L得到合適的補(bǔ)償)。另外，固靶序列也不可能都用于雜交，所以，由公式預(yù)計(jì)的隨探針長度增加的雜交率不一定總是正確的。
（五)雜交最適溫度
雜交技術(shù)最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應(yīng)溫度。若反應(yīng)溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯配對減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30℃)，雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結(jié)合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調(diào)整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗(yàn)，即最適復(fù)性溫度、苛刻復(fù)性溫度及非苛刻復(fù)性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見表18-3。最適復(fù)性溫度（Optimunm renaturation temperature, TOR)：Tor =Tm –25℃
苛刻復(fù)性溫度：Ts = Tm – (10或15℃)
非苛刻復(fù)性溫度：Tns =Tm – (30或35℃)
在2×SSC反應(yīng)液中，可以根據(jù)下列公式計(jì)算最適復(fù)性溫度：TOr =0.51 (G+C%)+47℃。
表18-4 DNA—DNA雜交溫度的選擇范圍（2×SSC)
|
DNA中 G+C mol% |
雜交反應(yīng)溫度（℃) | ||
|
TOR |
Ts |
Tns | |
|
30 |
62.3 |
73.3 |
52.3 |
|
35 |
64.9 |
74.9 |
54.9 |
|
40 |
67.4 |
77.4 |
57.4 |
|
45 |
70.0 |
80.0 |
60.0 |
|
50 |
72.5 |
82.5 |
62.5 |
|
55 |
75.1 |
85.1 |
65.1 |
|
60 |
77.6 |
87.6 |
67.6 |
|
65 |
80.2 |
90.2 |
70.2 |
|
70 |
82.7 |
92.2 |
72.7 |
|
75 |
85.3 |
95.3 |
75.3 |
可以看出DNA復(fù)性和DNa –RNA, DNA-DNA雜交通常要在高溫反應(yīng)條件下進(jìn)行,其反應(yīng)的最大速度是在低于Tm值約25℃。然而對于那些反應(yīng)時(shí)間需要延長,或?qū)ι锘钚员仨毐Ｗo(hù)的復(fù)雜生物的核酸研究(如哺乳動物),核酸長時(shí)間處于高溫下很顯然是不利的。這會引起核酸鏈的斷裂、膠嘌呤的作用，結(jié)合到膜上的DNA脫落也會增多。這個問題可以通過使用高濃度鹽溶液（如6.2mol/l NaCl)，或使用某些有機(jī)溶劑的水溶液降低反應(yīng)溫度來解決。常使用的有機(jī)溶劑有兩類，甲酰胺和二甲亞砜（DMSO)。在雜交液中加入30%二甲亞砜可使T2噬菌體DNA的Tm值比原先降低14℃，而使用酰胺甚至可使DNA在室溫下變性和復(fù)性。Mc-Conaughy等發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。
現(xiàn)在認(rèn)為，適當(dāng)選擇甲酰胺和鹽水濃度及合適的反應(yīng)溫度，可使DNA復(fù)性和DNA-RNA雜交獲得高特異性和更快的反應(yīng)速度。
�。�)雜交的嚴(yán)格性
影響雜交體穩(wěn)定性的因素決定著雜交條件的嚴(yán)格性。一般認(rèn)為在低于雜交體Tm值25℃時(shí)雜交最佳，所以首先要根據(jù)公式（4)計(jì)算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié) 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。對用20個堿基以上的探針做DNA：DNA雜交的Tm值計(jì)算如下：
n =雜交體中最短鏈的長度，因此，對一個G+C為42%的500個堿基探針于5×SSC（0.75mol/l Na+)和50%甲酰胺雜交的Tm 值為：
T=81.5 +(-2.07)+ 17.22 –1 –(30.5) =65℃
T雜交 =65℃–25℃=40℃
影響TM值的其它因素：
（1)對克隆或合成探針而言，同源性每下降1%，Tm值就降低1.5℃，15～50個堿基的寡核苷酸探針的這種作用更明顯。
�。�2)RNA：DNA雜交體的Tm值較同樣的DNA：DNA雜交體的高10～15℃。
�。�3)RNA：RNA雜交體的Tm值較同樣的DNA：DNA雜交體的高20～25℃。
顯然，當(dāng)用RNA為靶序列時(shí)，要使用甲酰胺來降低Tm 值以保證合適的雜交溫度。當(dāng)以克隆的探針進(jìn)行膜雜交時(shí)，在最后的漂洗步驟中應(yīng)達(dá)到最嚴(yán)格的條件。對一個500個堿基探針而言，典型最終漂洗條件點(diǎn)0.1×SSC（0.015mol/l Na+),55℃。代入公式（4)可得：
Tm =81.5 (-30.3) +17.22 –1-0 =67℃
67℃-55℃=12℃
因此，較Tm低12℃的漂洗條件比Tm 低25℃的雜交相比條件更嚴(yán)格了。
對寡核苷核探針而言，雜交溫度往往低于Tm5℃，因此，對一個G+C為50%的30nt寡核苷酸探針來說，Tm 值為：
T雜交=55℃-5℃=50℃
下面一個經(jīng)典的公式適用于14-20個堿基的寡核苷酸探針：
Tm = 4℃（g + C) +2℃（a + T)
在實(shí)際應(yīng)用中，寡核苷酸探針的最佳雜交溫度必須精確確定。最方便的一種方法是制備一張含不同稀釋度靶DNA和非特異靶DNA（如魚精或大腸桿菌DNA)的膜。在不同溫度下使膜與探針雜交，特異靶序列結(jié)合探針信號很強(qiáng)，而非特異靶序列與探針無任何反應(yīng)的溫度就是最適溫度，在某些條件下，可用二甲亞砜（DMSO)代替甲酰胺來降低Tm值。
用一個以上的探針的（如夾心雜交)雜交系統(tǒng)中，估計(jì)Tm值更加復(fù)雜。可用上述公式估計(jì)每一探針的Tm 值。然后求其均值作為雜交溫度。
�。ㄆ�)雜交反應(yīng)時(shí)間
在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co)和反應(yīng)時(shí)間（t)的乘積。實(shí)驗(yàn)表明Cot =100時(shí)，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒有 雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的DNa 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計(jì)算，總的吸收值為9.6)，如果反應(yīng)時(shí)間為21h，那么對于未標(biāo)記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8, 雜交完成了。對標(biāo)記Dn A（濃度為0.1μg/ml)來說Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。
�。ò�)雜交促進(jìn)劑
惰性多聚體可用來促進(jìn)250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機(jī)剪切或隨機(jī)引物標(biāo)記的探針可增加高達(dá)100倍。而短探針不需用促進(jìn)劑，因其復(fù)雜度低和分子量小，短探針本身的雜交率就高 。
硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進(jìn)劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500000。另一種常見的促進(jìn)劑是聚乙二醇（PEG)，PEG分子量�。�6000～8000)、粘度低、價(jià)格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產(chǎn)生很高的本底。因此，使用促進(jìn)劑時(shí)有必要優(yōu)化條件。另一種多聚體促進(jìn)劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)格低廉，粘度低（MW=90000)。
小分子化學(xué)試劑酚和硫氰酸胍也能促進(jìn)雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發(fā)揮作用。酚作為雜交促進(jìn)劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復(fù)性技術(shù)，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應(yīng)用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進(jìn)RNA的雜交，有裂解細(xì)胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進(jìn)劑。
