針對外來抗原的抗體分子(Ab1)可變區(qū)上Id可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗Id抗體(Ab2)。Ab2β具有與外來抗原相似的氨基酸排列順序或空間構(gòu)型,它能夠在體內(nèi)模擬始動抗原的作用。應(yīng)用Ab2β的這一特性,可有目的地制備Ab2β,將其作為抗原的替代物用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究。
(一)抗原及其用量的選擇
由于Ab2是針對Ab2Id的抗體,因而制備Ab2時應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)腁b1作為免疫原。所用抗原的用量依照給予抗原的種類、次數(shù)、途徑以受體動物的耐受性而有所不同。一般來說,當(dāng)受體動物為小鼠時,常用Ab1最為50-200μg;若受體動物為家兔時,使用的Ab1量可達(dá)100-200μg。
(二)免疫動物的選擇
抗獨(dú)特型抗體可在自身體內(nèi)、同類系、同種異體以及異種動物中誘導(dǎo)產(chǎn)生,因此在制備抗獨(dú)特型抗體時可根據(jù)不同情況選用同類系、同種異體或異種動物(表9-1)。從制備技術(shù)上講,可以制備單克隆抗Id和多克隆(免疫血清)抗Id。
表9-1 不同宿主免疫系統(tǒng)識別的抗體決定簇及抗獨(dú)特型抗體的制備
受體動物(應(yīng)答者) | 提供Ab1的動物(刺激者) | Ab1分子上的抗原決定簇類型 | 產(chǎn)生Ab2的類型 |
家兔 | BALB/c小鼠 | 同種型 | 抗同種型 |
獨(dú)特型 | 抗同種型 | ||
C59BL/6小鼠 | BALB/c小鼠 | 同種異型 | 抗同種異型 |
獨(dú)特型 | 抗同種型 | ||
BALB/c小鼠 | BALB/c小鼠 | 獨(dú)特型 | 抗同種型 |
1.同類系動物 用某一種抗原免疫某一品系的動物,分離純化的Ab1再免疫相同品系的另外一只動物,可獲得抗獨(dú)特型體。例如Uytdegaag等將Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒免疫BALB/c小鼠,經(jīng)雜交瘤技術(shù)制備了單克隆抗體(Ab1),再用Ab1免疫BALB/c小鼠,制備了單克隆Ab2。
2.同種異型動物 Seto等從一只品系為a3b4家兔血清中純化出IgG作為Ab1,然后免疫B/J品系家兔,得到了含有Ab2的免疫血清。用此方法制備的抗血清中,除了含有抗Id外,還含有抗同種異型決定簇的抗體。
3.異種動物 例如用人IgM作為Ab1免疫小鼠制備單克隆Ab2。由異種動物免疫制備的Ab2血清中,除抗Id外還含有抗同種型的抗體。
(三)抗獨(dú)特型抗體的檢測
抗Id抗體的鑒定至關(guān)重要。通常采用免疫學(xué)檢測方法如ELISA、RIA、免疫熒光和中和試驗等,可根據(jù)具體條件和需要加以選用?笽d的鑒定必須設(shè)置充分的對照,確保檢測結(jié)果的可靠性。例如,在鑒定小鼠源性抗原特異性人IgM抗獨(dú)特型抗體時,用正常人IgM作為對照。將Ab1(抗原特異性人IgM)包被微孔板,然后加檢測樣品(小鼠源性抗Id),再加抗鼠的標(biāo)記抗體,為了克服非特異性鼠抗人IgM同種型Ig造成的假陽性,同時用非特異性人IgM包被微板作為對照(圖9-9)。當(dāng)試驗孔為陽性、對照孔為陰性時可基本確定為抗Id抗體。
圖9-9 用ELISA間接法檢測鼠源性單克隆抗Id示意圖
抗獨(dú)特型抗體不僅對于免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的理論研究具有重要意義,而且在傳染性疾病的預(yù)jfsoft.net.cn/pharm/防、自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)理研究和惡性腫瘤的治療等應(yīng)用研究中也具有重要的價值。
(一)抗獨(dú)特型抗體與疫苗
抗獨(dú)特型抗體中Ab2β作為抗原的模擬物,可代替病原體的抗原,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗病原體的特異性免疫應(yīng)答,即所謂抗獨(dú)特型疫苗(anti-idiotype vaccine)。目前,抗獨(dú)特型疫苗研究仍處于動物實驗研究階段,疫苗的范圍主要有病毒、細(xì)菌和原蟲等引起的傳染病(表9-2)。
1.抗病毒的抗獨(dú)特型疫苗 針對病毒感染的抗獨(dú)特型疫苗是近年來較活躍的研究領(lǐng)域。Reagan將狂犬病毒糖蛋白特異的單克隆抗體免疫動物,制備出抗Id抗體,將這些抗體注射小鼠后,可誘導(dǎo)出具有病毒特異性中和活性的抗體應(yīng)答。Kennedy等用抗HBsAg抗體制備出抗獨(dú)特型抗體,經(jīng)親和層析純化后注射于BALB/c小鼠,誘導(dǎo)產(chǎn)生針對HBsAg的體液免疫應(yīng)答。
Uytdehaag等用對Ⅱ型脊隨灰質(zhì)炎病毒特異的保護(hù)性單克隆抗體(Ab1)免疫BALB/c小鼠,制備出單克隆Ab2,用Ab2免疫BALB/c小鼠后,可誘導(dǎo)出Ab3,產(chǎn)生抗脊髓灰質(zhì)炎病毒的保護(hù)性免疫,這種單克隆Ab2可用于預(yù)防Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒的感染。Tanaka等在BALB/c小鼠中用抗新城疫病毒(NDV)血凝素的抗體誘導(dǎo)出抗Id抗體,在無病毒抗原存在的情況下,這種抗Id抗體可刺激小鼠產(chǎn)生抗NDV抗體。Lathey用單純皰疹病毒(HSV)糖蛋白D特異的McAb制備了抗Id抗體,并在小鼠中誘發(fā)對HSV的免疫應(yīng)答。用人工合成HIV包膜抗耕牛的735-752氨基酸段的多肽免疫黑猩猩制得Ab1,再用Ab1免疫家兔制備Ab2,將Ab2免疫小鼠獲得Ab3,實驗表明,Ab3能與HIV多肽抗原發(fā)生特異性結(jié)合。
圖9-10 HBsAg抗Id的實驗研究(Kennedy,1984)
2.抗細(xì)胞菌和原蟲的抗獨(dú)特型疫苗 抗Id抗體也可用于誘導(dǎo)針對細(xì)菌和原蟲的保護(hù)性免疫應(yīng)答。例如,用Ab2誘導(dǎo)動物針對肺炎球菌、大腸桿菌(K13)、血吸蟲和羅德西亞錐蟲等病原體的保護(hù)性免疫。其Ab2的制備和研究方法與病毒性抗Id疫苗研究類似。
抗Id作為疫苗有以下優(yōu)點(diǎn):(1)不含有傳染性物質(zhì);(2)可大量制備抗Id的McAb;(3)某些保護(hù)性抗原決定簇為碳水化合物,不能用DNA重組技術(shù)獲得,而某些抗Id可模擬碳水化合物抗原決定簇;(4)能誘導(dǎo)比滅活病毒更為有效的T細(xì)胞應(yīng)答;(5)誘導(dǎo)抗原決定簇特異性的抗Id疫苗。應(yīng)該看到,抗Id疫苗的免疫應(yīng)答水平一般較低,大劑量鼠源性免疫球蛋白可能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗異種蛋白的免疫反應(yīng)以及過敏反應(yīng)。因此,在臨床實際應(yīng)用中,制備人源性抗Id疫苗,應(yīng)該看到,抗Id疫苗的免疫應(yīng)答水平一般較低,大劑量鼠源性免疫球蛋白可能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗異種蛋白的免疫反應(yīng)以及過敏反應(yīng)。因此,在臨床實際應(yīng)用中,制備人源性抗Id疫苗,提高抗Id疫苗的免疫原性,以及細(xì)胞工程和基因工程相結(jié)合等方面有待進(jìn)一步深入研究。
(二)抗獨(dú)特型抗體與自身免疫性疾病
自身免疫病是機(jī)體產(chǎn)生對自身成份的免疫應(yīng)答并造成病理損害而引起的一系列疾病,常與自身隱蔽抗原的釋放、自身反應(yīng)的T細(xì)胞克隆激活以及由于具有與自身交叉反應(yīng)抗原的病原體感染有關(guān)。隨著免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說和抗獨(dú)特型抗體研究的發(fā)展,進(jìn)一步提示了抗獨(dú)特型抗體與某些自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。
表9-2 抗獨(dú)特型疫苗的研究
抗獨(dú)特型疫苗種類 | 作者 |
病毒 | |
狂犬病毒糖蛋白 | Reagan等(1983) |
呼腸孤病毒 | Sharpe等(1984) |
HBsAg | Kennedy等(1984,1986) |
Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒 | Uytdehaag等(1985) |
新城疫病毒血凝素 | Tanaka等(1986) |
HSV-1糖蛋白D | Lathey等(1986) |
腎綜合征出血熱病毒 | 米力等(1993) |
細(xì)菌 | |
肺炎球菌 | McNamara等(1984) |
大腸桿菌(K13) | Stein等(1984) |
肺炎球菌 | Ward等(1987) |
原蟲 | |
瘧原蟲 | Naussenzweig等(1980) |
非洲錐蟲 | Sack等(1982) |
血吸蟲 | Grzych等(1985) |
1.抗獨(dú)特型抗體與重癥肌無力 1971年,Bartels等合成了稱之為Bis-Q(trans-3,3`-bis[(α-trimethylammonio methyl)azobenzene]的化合物,發(fā)現(xiàn)Bis-Q可模擬乙酰膽鹼(acetylcholine,Ach)與乙酰膽鹼受體(acetylcholinereceptor,AchR)結(jié)合。繼而,Erlanger將Bis-Q與蛋白載體交聯(lián),制備了Bis-Q特異性抗體。1982年Wassermann等用抗Bis-Q抗體免疫家兔,由于抗Bis-Q能模擬AchR,免疫后產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體可模擬抗AchR,結(jié)果在接受抗Bis-Q免疫的5只家兔中,在第1次加強(qiáng)免疫后就有4只產(chǎn)生了實驗性重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)的癥狀,但第2次加強(qiáng)免疫后MG癥狀又有所減輕。他們認(rèn)為,第1次免疫后產(chǎn)生了抗AchR,阻斷了運(yùn)動終板處Ach與AchR的結(jié)合,與MG的癥狀產(chǎn)生有關(guān)。而第2次免疫后,由于注入的抗Bis-Q對血清中抗AchR抗體有中和作用,抑制了抗AchR的作用,使MG癥狀緩解。重癥肌無力患者血清中,除了發(fā)現(xiàn)有抗AchR的自身抗體外,還可能存在針對Ach抗體的抗Id抗體,Ach可刺激抗Ach抗體的產(chǎn)生,Ab1可變區(qū)的Id又可刺激抗Id抗體產(chǎn)生,Ab2作為Ach的模擬和換封閉了神經(jīng)肌肉接頭的AchR,從而導(dǎo)致神經(jīng)-肌肉接頭功能障礙,發(fā)生MG癥狀。
圖9-11 Bis-Q、αBisQ和ααBis-Q與實驗性MG發(fā)生的關(guān)系
1984年,Erlanger等又進(jìn)一步以α-Bis-Q為抗原免疫小鼠,制備了分泌ααBis-QId McAb的雜交瘤細(xì)胞株,將此雜交瘤細(xì)胞注入到小鼠腹腔,小鼠發(fā)生自身免疫性MG,這是由于雜交瘤所分泌的αα-Bis-QId McAb可模擬抗AchR抗體的作用,與Bis-Q的封閉作用相似。
2.抗獨(dú)特型抗體與促甲狀腺受體病 甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)(簡稱甲亢)的病因尚不十分清楚。以往認(rèn)為,病人血清中存在著抗促甲狀腺素受體(thyroid stimulating lormone receptor,TSHR)的抗體,由于該抗體與TSHR的結(jié)合可模擬TSH的配體作用,因而刺激產(chǎn)生甲狀腺素,導(dǎo)致患都產(chǎn)生甲亢的癥狀,并將抗TSHR稱為長效甲狀腺刺激素(long acting thyroidstimulator,LATS)。以后研究發(fā)現(xiàn)針對抗TSH的獨(dú)特型抗體中有一部分應(yīng)能模擬TSH的作用,能與TSHR結(jié)合而刺激甲狀腺素的分泌。
進(jìn)一步研究證實:(1)來自甲亢患者血清中TSHαId可促進(jìn)甲狀腺上皮細(xì)胞對碘的攝。唬2)αId作為TSHR的配體,檢測到TSHR的分子量為197kDa;(3)αId的Fab段可直接與TSh McAb結(jié)合并TSH與TSH McAb的結(jié)合,TSH也可抑制αId與TSHR的結(jié)合。
3.抗獨(dú)特型抗體與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中存在類風(fēng)濕因子(rheumatoid tacfor,RF),在來自不同個體的類風(fēng)濕因子之間存在著不同程度的交叉反應(yīng),表明這些RF存在著交叉反應(yīng)獨(dú)特型(IdX)。Bona等在研究針對人IgM型RF的IdX時,發(fā)現(xiàn)一種特殊的抗獨(dú)特型抗體,稱為epidody,這種抗體不僅能與IgM類風(fēng)濕因子可變區(qū)結(jié)合,同時也可與IgG的Fc段結(jié)合。Chen等合成了與該種Igm RF可變區(qū)IdX中氨基酸序列相同的一段多肽作為抗原,免疫家兔制備抗體,結(jié)果該抗體可與Igm RF的輕鏈和IgG結(jié)合,提示IgMRF的輕鏈和IgG上具有交叉反應(yīng)性抗原決定簇。以上述實驗為依據(jù),似乎存在這樣的可能:由RF刺激機(jī)體產(chǎn)生的epibody可廣泛地與人Igg Fc段結(jié)合,所形成的免疫復(fù)合物沉積于關(guān)節(jié)滑膜等部位,導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫損傷。此外,有人認(rèn)為許多自身抗體上具有交叉反應(yīng)Id,這些IdX與外界微生物感染時誘發(fā)產(chǎn)生抗體的Id有交叉反應(yīng)。當(dāng)相應(yīng)的微生物感染機(jī)體時,刺激產(chǎn)生特異性抗體以及相應(yīng)的抗Id抗體,后者可通過與自身抗體可變區(qū)上IdX的相互作用,誘發(fā)自身免疫應(yīng)答,從而導(dǎo)致免疫損傷。
(三)抗獨(dú)特型抗體與腫瘤免疫
表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的腫瘤相關(guān)抗原刺激小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的抗體(Ab1),用這種Ab1免疫另一小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對Ab1的抗獨(dú)型抗體,其中Ab2β(模擬腫瘤相關(guān)抗原)注入荷腫瘤的動物或病人可誘導(dǎo)出稱之為抗-抗-獨(dú)特型抗體的Ab3,由于這種Ab3與最初腫瘤相關(guān)抗原所誘導(dǎo)的Ab1具有相同的抗原特異性,因此又稱為Ab1`。
圖9-12 模擬腫瘤相關(guān)抗原的Ab2β誘導(dǎo)出Ab3(Ab1`)
采用模擬腫瘤相關(guān)抗原的Ab2β刺激機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答,已在許多動物實驗中得到證實,包括B淋巴細(xì)胞腫瘤、T細(xì)胞性白血病、乳腺癌、黑素瘤、小鼠肉疚、結(jié)腸癌、胰腺癌等(表9-3)。目前,有幾種腫瘤相關(guān)抗原抗Id已開始臨床I期驗證,有些病例顯示出一定的療效。
Lery等(1982、1985)應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù),制備了針對病人結(jié)節(jié)性淋巴瘤B細(xì)胞表面免疫球蛋白的αId(4D6),獲得一定的療效(圖9-13)。
在實驗研究中發(fā)現(xiàn),有的腫瘤相關(guān)抗原如黑素瘤相關(guān)蛋白聚糖(MPG)難于在動物體內(nèi)誘導(dǎo)出MPG特異性抗體,但是模擬MPG抗原的Ab2β可誘導(dǎo)出腫瘤相關(guān)抗原的特異性抗原,提示Ab2β可能通過打破機(jī)體對某些腫瘤相關(guān)抗原的天然免疫耐受,從而誘導(dǎo)相體產(chǎn)生抗腫瘤相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答。
需要注意的是抗Id在一定條件下可抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答。Flood等(1980)報道了由抗IdT細(xì)胞所誘導(dǎo)的免疫抑制作用。小鼠纖維肉瘤1591和1316都有很強(qiáng)的免疫原性,在正常情況下移植到小鼠體內(nèi)后100%被排斥。如先用纖維肉瘤1591效應(yīng)T淋巴母細(xì)胞(含TCr Id)免疫正常同類系小鼠,然后分為兩組,分別移植1591和1316肉瘤,結(jié)果發(fā)現(xiàn),移植1591組約有2/3小鼠喪失排斥肉瘤的能力,而移植1316組仍100%被排斥,說明TCr Id T淋巴母細(xì)胞所誘導(dǎo)的免疫抑制作用是特異性的,其機(jī)理可能是αIdT細(xì)胞殺傷或抑制了肉瘤特異性T效應(yīng)細(xì)胞。
表9-3 腫瘤相關(guān)抗原抗Id臨床前研究和臨床I期驗證(舉例)
腫瘤相關(guān)抗原 | Ab1 | Ab2 | 治療腫瘤 | 應(yīng) 用 情 況 |
T細(xì)胞腫瘤抗原gp37(SN2腫瘤相關(guān)抗原) | SN2(McAb) | 4DC6(McAb) | 皮膚性T淋巴瘤(CTCL) | 在家兔和小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出Ab3,與絕jfsoft.net.cn/jianyan/大多數(shù)CTCL發(fā)生結(jié)合反應(yīng),已開始I期臨床驗證 |
高分子量癌胚抗原(HMW-CEA) | 116NS-3d(3019)(McAb) | 3H1(McAb) | 人結(jié)腸癌、胰腺癌 | 在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出Ab3,特異性結(jié)合CEA和結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T |
黑素瘤相關(guān)蛋白聚糖(MPG) | 在猴子體內(nèi)誘導(dǎo)出Ab3,與大多數(shù)人黑素瘤細(xì)胞結(jié)合,抑制黑素瘤細(xì)胞侵入基底膜基質(zhì);免疫沉淀出MPG | |||
乳腺癌粘蛋白樣蛋白(400kDa) | MC-10 | 11D2 | 乳腺癌 | 在不同種動物誘導(dǎo)出Ab3,與MC-10陽性抗原發(fā)生結(jié)合反應(yīng) |
小鼠肉瘤MCA-1490 | 4.72(McAb) | MCA-1490 | 抑制小鼠肉瘤生長,誘發(fā)MCA1490肉瘤特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng) | |
結(jié)節(jié)性淋巴瘤 | 4D6 | B細(xì)胞瘤 | 對腫瘤病人本身有作用,約50%病人病性緩解 | |
結(jié)腸直腸癌相關(guān)抗原 | 17-1A GA733 | 多克隆抗體(羊) | 結(jié)腸直腸癌 | Ab2注入晚期病人能產(chǎn)生Ab3,能與結(jié)腸腫瘤細(xì)胞發(fā)生結(jié)合反應(yīng),約43%病人有改善 |
人高分子量黑素瘤抗原(high-MrMAA) | MK2-23(McAb) | 黑素瘤 | 部分病人產(chǎn)生的病人療效優(yōu)于不產(chǎn)生Ab3病人,近20%病人轉(zhuǎn)移腫瘤縮小 |
注:CTLC:cutaneousT cell lymphoma
CEA:carcinoembryonic antigen
MPG:melanoma-associatedproteoglycan
high-MrMAA:human high molecularmass melanoma associated antigen
圖9-13 抗Id(4D6)治B細(xì)胞瘤示意圖
(金伯泉 許輝)