生物化學與分子生物學:第二節(jié)　基因工程載體

基因工程是要按人們的意愿去有目的地改造，創(chuàng)建生物遺傳性，因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。分離或改建的基因和核酸序列自身不能繁殖，需要載體攜帶它們到合適的細胞中復制和表現(xiàn)功能。對理想的基因工程載體一般至少有以下幾點要求：

①能在宿主細胞中復制繁殖，而且最好要有較高的自主復制能力。

②容易進入宿主細胞，而且進入效率越高越好。

③容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進入宿主細胞和在細胞中的復制。這就要求載體DNA上要有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點。

④容易從宿主細胞中分離純化出來，這才便于重組操作。

⑤有容易被識別篩選的標志，當其進入宿主細胞、或攜帶著外來的核酸序列進入宿主細胞都能容易被辨認和分離出來。這才介于克隆操作。

常用的載體有質(zhì)粒，噬菌體和病毒等。

一、質(zhì)粒載體

質(zhì)粒（plasmid)是細菌或細胞染色質(zhì)以外的，能自主復制的，與細菌或細胞共生的遺傳成分。其特點如下：

①是染色質(zhì)外的雙鏈共價閉合環(huán)形DNA（covalentlyclosed circuar DNA,cccDNA)，可自然形成超螺旋結(jié)構(gòu)，不同質(zhì)粒大小在2-300kb之間，＜15kb的小質(zhì)粒比較容易分離純化，＞15kb的大質(zhì)粒則不易提取。

②能自主復制，是能獨立復制的復制子（autonomous replicon)。一般質(zhì)粒DNA復制的質(zhì)�？呻S宿主細胞分裂而傳給后代。按質(zhì)粒復制的調(diào)控及其拷貝數(shù)可分兩類：嚴緊控制（stringent control)型質(zhì)粒的復制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個細胞中只有1個到十幾個拷貝；另一類是松弛控制（relaxed control)型質(zhì)粒，其復制宿主不偶聯(lián)，每個細胞中有幾十到幾百個拷貝。每個質(zhì)粒DNA上都有復制的起點，只有ori能被宿主細胞復制蛋白質(zhì)識別的質(zhì)粒才能在該種細胞中復制，不同質(zhì)粒復制控制狀況主要與復制起點的序列結(jié)構(gòu)相關(guān)。有的質(zhì)粒的可以整合到宿主細胞染色質(zhì)DNA中，隨宿主DNA復制，稱為附加體，例如細菌的性質(zhì)粒就是一種附加體，它可以質(zhì)粒形式存在，也能整合入細菌的DNA，又能從細菌染色質(zhì)DNA上切下來。F因子攜帶基因編碼的蛋白質(zhì)能使兩個細菌間形成纖毛狀細管連接的接合（conjugation)，通過這細管遺傳物質(zhì)可在兩個細菌間傳遞。

③質(zhì)粒對宿主生存并不是必需的。這點不同于線粒體，線粒體DNA也是環(huán)狀雙鏈分子，也有獨立復制的調(diào)控，但線粒體的功能是細胞生存所必需的。線粒體是細胞的一部分，質(zhì)粒也往往有其表型，其表現(xiàn)不是宿主生存所必需的，但也不妨礙宿主的生存。某些質(zhì)粒攜帶的基因功能有利于宿主細胞的特定條件下生存，例如，細菌中許多天然的質(zhì)粒帶有抗藥性基因，如編碼合成能分解破壞四環(huán)素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，這種質(zhì)粒稱為抗藥性質(zhì)粒，又稱R質(zhì)粒，帶有R質(zhì)粒的細菌就能在相應的抗生素存在生存繁殖。所以質(zhì)粒對宿主不是寄生的，而是共生的。醫(yī)學上遇到許多細菌的抗藥性，常與R質(zhì)粒在細菌間的傳播有關(guān)，F(xiàn)質(zhì)粒就能促使這種傳遞。

圖20-2　pBR322及pUC18圖譜

現(xiàn)在分子生物學使用的質(zhì)粒載體都已不是原來細菌或細胞中天然存在的質(zhì)粒，而是經(jīng)過了許多的人工的改造。從不同的實驗目的出發(fā)，人們設(shè)計了各種不同的類型的質(zhì)粒載體，近年來發(fā)展很快，新的有特定用途的質(zhì)粒不斷被創(chuàng)建。圖20-2給出最常用的大腸桿菌克隆用質(zhì)粒pUC19的圖譜，此質(zhì)粒的復制起點處序列經(jīng)過改造，能高頻率起動質(zhì)粒復制，使一個細菌pUC19的拷貝數(shù)可達500-700個；質(zhì)粒攜帶一個抗氨芐青霉素基因，編碼能水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而被壞氨芐青霉素的酶，當用pUC19轉(zhuǎn)化細菌后放入含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，凡不含pUC19者都不能生長，結(jié)果長出的細菌就是都含有pUC19的；pUC19還攜帶細菌lac操縱元中的lacI和lacZ基因編碼，β-半乳糖苷酶N端狀146個氨基酸的段落，當培養(yǎng)基中含有誘導物IPTG和Xgal時，lacz " 基因被誘導表達產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶N端肽與宿主菌表達的C端肽互補而具有β-半乳糖苷酶活性（質(zhì)粒和宿主編碼的肽段各自都沒有酶活性，兩都融為一體而具酶活性，稱為α-互補，α-complementation)，半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈現(xiàn)藍色；在lacz "中間又插入了一段人工設(shè)計合成的DNA序列，其中密集多個常用的限制性核酸內(nèi)切酶的位點，使外來的基因和序列能很方便地被插入此位置，當外來序列插入后則破壞了lacz "編碼的半乳糖苷酶活性，生長的菌落就呈白色，這種顏色標志的變化就很容易區(qū)分和挑選含有和不含有插入序列或基因的轉(zhuǎn)化菌落，稱為藍白篩選法。

除常用的大腸桿菌質(zhì)粒載體外，近年來發(fā)展了許多人工構(gòu)建的其它能用于微生物、酵母、植物等的質(zhì)粒載體。含有不止一個ori、能攜帶插入序列在不同種類宿主細胞中繁殖的載體稱為穿梭載體（shuttlevectors)。

二、噬菌體載體

噬菌體（phage)是感染細菌的一類病毒，有的噬菌體基因組較大，加入λ噬菌和T噬菌體等；有的則較小，如M13、f1、fd噬菌體等。用感染大腸桿菌的λ噬菌體改造成的載體應用最為廣泛。

λ噬菌體由頭和尾構(gòu)成，其基因組是長約49kb的線性雙鏈DNA分子，組裝在頭部蛋白質(zhì)外殼內(nèi)部，其序列已被全部測出。λ噬菌體感染時，通過尾管將基因組DNA注入大腸桿菌，而將其蛋白質(zhì)外殼留在菌外。DNA進入大腸桿菌后以其兩端12bp的互補單鏈粘末端環(huán)化成環(huán)狀雙鏈，可以兩種不同的方式繁殖（圖20-3)：①溶菌性方式（lyticpathway)：在營養(yǎng)充足，條件適合細菌繁殖時，利用宿主菌中的酶類和原料，λDNA上基因可按調(diào)控的順序表達合成構(gòu)成噬菌體頭、尾和尾絲所需的各種蛋白質(zhì)，λDNA經(jīng)多次復制合成許多子代λDNA，于是裝配成許多子代的λ噬菌體，最后裂菌，釋放出許多新的λ噬菌體。②溶原性方式（lysogenic pathway)：進入細菌的λDNA可整合(integrate)入細菌的染色質(zhì)DNA中，隨細菌染色體DNA復制，傳給細菌后代，這個穩(wěn)定潛伏在細菌染色質(zhì)DNA中的λDwww.med126.comNA稱為原噬菌體(prophage)，含有原噬菌體的細菌稱為溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的，原噬菌體可從宿主DNA中切出，進入溶菌性方式的繁殖。

圖20-3　λ噬菌體的溶菌和溶原繁殖方式

λ噬菌體整個基因組如圖20-4所示，可分為三個部分，①左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。②中段：長約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列。③右臂：長約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含λDNA復制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必需的。

利用λ噬菌體作載體，主要是將外來目的DNA替代或插入中段序列，使其隨左右臂一起包裝成噬菌體，去感染大腸桿菌，并隨噬菌體的溶菌繁殖而繁殖�，F(xiàn)在廣泛使用的λ噬菌體載體也是已作過許多人工改造的，主要的改造是：①設(shè)計去除λDNA上的一些限制性酶切點。這是因為λDNA較大，序列中的限制性酶切點過多，妨礙其應用。②在中段非必需區(qū)，替換插入某些標志基因如上述的可供藍白篩選lacI-lacZ’序列，和多克隆位點等。由此可構(gòu)建出兩類λ噬菌體作載體；一類是插入型載體，可將外來序列插中段，常用的λgt系列載體，一般容許插入5-7kb外來DNA；另一類是轉(zhuǎn)換型載體，即可用外來DNA替代中段，如IMBL系列載體。

圖20-4　野生型λ噬菌體DNA及相應的λ噬菌體DNA圖譜

插入或置換中段外來的DNA長度是有一定限制的，當噬菌體DNA長度大于野生型λ噬菌體基因組105%或小于78%時，包裝而成的噬菌體存活力顯著下降。所以λ噬菌體載體可插入長5-20kb的外來DNA，這比質(zhì)粒載體能插入的DNA長得多；而且包裝的λ噬菌體感染大腸桿菌要比質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細菌的效率高得多，所以λ噬菌體載體常用于構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫。但λ噬菌體載體的克隆操作要比質(zhì)粒載體復雜。

如果將左右臂和中段都去除，僅留下λDNA而端包裝噬菌體所必需的cos序列，再加上質(zhì)粒的復制序列、標志基因、多克隆位點等，就可構(gòu)成cos質(zhì)�；蚍Q為粘粒的載體。粘�？刹迦�45kb長的外源DNA，然后用λ噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌后，粘粒的DNA能以質(zhì)粒的形式在細菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文庫的構(gòu)建。

三、動物病毒載體

質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。由于動物細胞的培養(yǎng)和操作較復雜、花費也較多，因而病毒載體構(gòu)建時一般都把細菌質(zhì)粒復制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。目前病毒載體常用者有改造www.med126.com來自猴腎病毒SV40（Simian Virus 40)、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動物細胞中表達或試驗其功能、或作基因治療等（見后)。

人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和篩選人的基因組文庫，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeast artificial chromosome,YAC)載體應運而生。YAC含有酵母染色體端粒（telesome)、著絲點(centromere)及復制起點等功能序列，可插入長度達200-500kb的外源DNA，導入酵母細胞可以隨細胞分裂周期復制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計劃的重要