實用免疫細胞與核酸:第二節(jié)　分子克隆載體

載體（vector)是指運載外源DNA有效進入受體細胞內(nèi)的工具。載體同外源DNA在體外重組成DNA重組分子，在進入受體后形成一個復制子，即形成在細胞內(nèi)能獨自進行自我復制的遺傳因子。因此，作為載體應該滿足以下幾方面jfsoft.net.cn/wszg/的要求：①有某種限制酶的一個切點，最好是有許多種限制酶的切點，而且每種酶的切點只有一個；②外源DNA插入后不影響載體在受體細胞中進行自我復制，載體應對受體細胞無害，以及載體能接納盡可能大的外源DNA片段；③有利于選擇的標記基因，可以很方便地知道外源DNA已經(jīng)插入，以及把接受了載體的受體細胞選出；④具有促進外源DNA表達的調控區(qū)。

重組DNA技術中最常用的載體有質粒、噬菌體λ，柯斯質粒（cosmid)和噬菌體M13。它們的受體細胞都是大腸桿菌。這四種載體的大小和結構盡管各不相同，但它們的共同特點是：①都能在大腸桿菌中自主復制，而且jfsoft.net.cn/hushi/能連同所帶的外源DNA一起復制；②都很容易同細菌DNA分開并加以純化；③都有一段DNA對于它們自身在細菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入這一段DNA中，或是置換這一段DNA而不影響載體的復制。根據(jù)這一特點，載體又可分成插入型和置換型兩大類。

一、質粒

質粒（plasmid)是許多種細菌中發(fā)現(xiàn)的染色體外的遺傳因子，它是閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子，大小從1kb直到200kb以上。質粒所帶的基因通常有利于宿主細胞。例如基因的產(chǎn)物是某些抗生素或對某些抗生素的抗性、能降解某些復雜的有機化合物、產(chǎn)生大腸桿菌素和腸毒素、產(chǎn)生限制酶或修飾酶等。

在天然條件下，許多種質粒是通過類似于細菌接合的過程傳遞給新的宿主。在實驗室條件下，質粒則可通過轉化過程進入受體細胞。此時，受體細胞已經(jīng)過處理而處于感受態(tài)，即它的細胞暫時易于讓小的DNA分子透過。受體細胞由于質粒的進入而產(chǎn)生了新的表型。如對某種抗生素的抗性，這樣就可用這種抗生素作為選擇條件，選出被質粒轉化的受體細胞。

質粒復制時利用宿主細胞復制自身染色體的同一組酶系。有些質粒處于“嚴緊控制”之下，即它們的復制是同宿主細胞的復制偶聯(lián)同步的。因此在每個細胞中的質粒只有一份拷貝，或最多只有幾份拷貝。這稱為“嚴緊型”質粒。另一些質粒則是處于“松弛控制”之下的“松弛型”質粒。每個細菌中可以有10～200份拷貝。更重要的是松弛型質粒的拷貝數(shù)，可因宿主細胞停止合成蛋白質而增加至幾千份。宿主細胞不合成蛋白質時，染色體和嚴緊型質粒的復制都中止。但松弛型質粒仍繼續(xù)進行復制。因此在增殖松弛型質粒時，總是要讓宿主菌經(jīng)氯霉素處理（在培養(yǎng)液中加入適量的氯霉素)抑制蛋白質的合成。

圖23-3　pBR322的基本結構

（一)大腸桿菌質粒

應用的最廣泛的質粒載體是pBR322，它屬松弛型質粒，有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素兩個抗性基因可作為標記基因，有許多種常用的限制酶的切點。它全長4352個核苷酸，排列順序已全部測定，基本結構如圖23-3。

當需要用pBR322來克隆BamHI酶切的一個DNA片段時，一般的做法是如圖23-4所示。

圖23-4　pBR322克隆DNA片段的程序

從圖23-4可見，外源DNA片段同pBR322都經(jīng)Bam HⅠ酶切，所以有相同的單鏈“粘性末端”，通過DNA連接酶可以構成重組DNA分子。由于pBR322的BamHⅠ酶切點在四環(huán)素的抗性基因中，所以Bam HⅠ酶切后使這個抗性基因失活。如果酶切后的質粒pBR322自身又重新連接，則恢復對四環(huán)素的抗性，轉化子就仍然具有對二種抗生素的抗性。如果pBR322中插入外源DNA，則轉化子失去了四環(huán)素抗性表型，而只有對氨芐青霉素的抗性，這樣就可根據(jù)轉化子的抗性而把重組質粒轉化的細菌選出，然后擴增細菌，大量回收質粒DNA，從而達到大量擴增外源DNA的目的。

（二)真核生物中的質粒

真核生物中的酵母是國內(nèi)外廣泛研究的載體-受體系統(tǒng)之一。這是一個共價閉環(huán)DNA分子（cccDNA)，平均周長2μm，所以稱為2μm DNA質粒，在每個酵母細胞里約有100個拷貝。已有人把2μm DNA同pBR322 DNA構建成雙功能質粒，可在大腸桿菌和酵母菌中復制。這種質粒帶有啤酒酵母的二個基因（his 3和Leu 2)，所以很容易用酵母的營養(yǎng)缺陷型菌株來選出。

二、噬菌體和病毒載體

噬菌體λ是最主要的一種載體。自從1974年以來，已用野生型λ改造和構建出一系列噬菌體載體。

噬菌體λ是溫和噬菌體�；�因組是長約50kb的雙鏈DNA分子。在噬菌體λ顆粒中，DNA是線狀雙鏈分子帶有單鏈的互補末端。末端長12個核苷酸，這稱為粘性末端，簡寫COS。當噬菌體感染宿主細胞后，雙鏈DNA分子通過COS而成環(huán)狀。在感染早期，環(huán)狀DNA分子進行轉錄。在此期間，噬菌體有兩條復制途徑可供選擇：一是裂解生長。環(huán)狀DNA分子在宿主細胞里復制若干次，合成了大量的噬菌體基因產(chǎn)物，形成子代噬菌體顆粒，成熟后使細菌裂解，釋放出許多新的有感染能力的病毒顆粒。另一是溶源性生長。噬菌體DNA整合進宿主菌的基因組，然后象細菌染色體上的基因一樣進行復制，并傳遞給下一代細菌。

（一)噬菌體λ載體的構建

野生型噬菌體λDNA全長約50kb，上有65種限制酶酶切點，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7種限制酶各有一個切點外，其余都多于2個。有些酶切點在λ增殖所必需的基因區(qū)域內(nèi)。因此，噬菌體λ必須經(jīng)過改造才能用作載體�，F(xiàn)在用的λ載體大都除去了某種限制酶的酶切點。因此，作為載體的噬菌體λ都短于野生型。

噬菌體λ載體有兩種類型：①插入型。由于改建后的噬菌體λDNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影響噬菌體增殖。而且噬菌體DNA缺失越長，插入片段就可越大。②置換型。噬菌體λ的基因組可分為三個區(qū)域，左側區(qū)包括使噬菌體DNA成為一個成熟的、有外殼的病毒顆粒所需的全部基因，全長約20kb。右側區(qū)內(nèi)包含所有的調控因子、與DNA復制及裂解宿主菌有關的基因，這個區(qū)域約長12kb。中間區(qū)域約長18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會影響噬菌體λ裂解生長的能力。置換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。

噬菌體λ裂解生長的能力同包裝在頭蛋白中的λDNA的大小有關。當DNA的長度短于野生型的78%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降。因此要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39～53kb之間。

置換型載體DNA用選定的限制酶完全酶切后，要設法除去中間片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段連接，包裝成重組噬噬體。這是因為左臂和右臂與中間片段間都有單鏈“粘性末端”，在連接酶作用下可以重新恢復原來的結構，從而影響了同外源DNA的連接。區(qū)分重組噬菌體形成的噬菌斑和重新恢復的載體噬菌體形成的噬菌斑的方法是用Xgal藍色噬菌斑試驗。有些噬菌體載體的中間片段帶有編碼β半乳糖苷酸的基因。當這種噬菌體感染lac宿主細胞并在含有Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷)的培養(yǎng)基上生長時，半乳糖苷酸與Xgal反應的產(chǎn)物為不溶性的靛藍染料。因此，含有中間片段的重新恢復的噬菌體形成藍色噬菌斑；而同外源DNA連接的重組噬菌體形成的噬菌斑是無色透明的。

（二)單鏈噬菌體載體

最常用的單鏈噬菌體載體是M13和它的改建噬菌體。M13是絲狀噬菌體，有長約6500個核苷酸的閉環(huán)DNA基因組。M13附著在大腸桿菌的F性菌毛上，所以它們只能感染雄性細菌，即F’或Hfr細菌。當噬菌體進入細菌細胞后，單鏈的噬菌體DNA轉變成雙鏈復制型（RF)。從細胞中分離的RF可用作克隆雙鏈DNA的載體。當每個細菌細胞里積聚了200到300份RF型拷貝時，M13開始不對稱的合成，即只大量合成DNA雙鏈中的一條鏈。單鏈DNA摻入成熟的噬菌體顆粒，顆粒不斷地從感染細胞上芽生。M13感染雖不殺死細胞，但細胞的生長受到一定的抑制，所以形成混濁的噬菌斑。

M13的基因組中除有一段507個核苷酸，其余都含有與其復制有關的遺傳信息。因此，只有在這一段中可插入外源DNA而不致影響噬菌體的活性。用M13作為分子克隆載體的優(yōu)點是從細菌中釋放出來的噬菌體顆粒只含單鏈DNA，其中包含了克隆DNA片段的二條互補鏈中的一條，因此可用來作為對DNA測序的模板。另外，可用來產(chǎn)生單鏈的DNA探針以選擇和分離互補的RNA。M13的RF型是雙鏈DNA，便于限制酶的識別和切割，克隆進雙鏈的外源DNA。從細菌培養(yǎng)液中大量抽取單鏈DNA。問題是插入M13的外源DNA超1000bp時就不穩(wěn)定，在噬菌體增殖時會出現(xiàn)缺失。一般說，插入300～400bp是相當穩(wěn)定的。

（三)猴病毒40（SV40)

猴病毒40（SV40)的基因組常用來作為克隆載體，把外源DNA轉入哺乳類細胞。猴病毒40是球形動物病毒，直徑40nm，呈20面體，有一個共價閉環(huán)的雙鏈DNA基因組，全長5244bp。它在猴腎中增殖。被SV40感染的細胞都會出現(xiàn)SV40的T抗原。早已證明完整的小鼠染色體β珠蛋白基因（包括所有的間插順序和兩側順序)整合在SV40中后，在被感染的猴腎細胞中都能正確地轉錄和翻譯。表明猴腎細胞的拼接系統(tǒng)能有效地處理小鼠β珠蛋白的初級轉錄本。

可是，SV40作為克隆載體有其局限性：①SV40基因組的晚期功能區(qū)的裂解性，不利于外源DNA的重組和表達；②早期功能區(qū)與病毒的致癌性有關，使用時有顧慮；③重組DNA片段的大小受體限制。

（四)逆轉錄病毒

逆轉錄病毒是RNA病毒，它有三個基因：gag-編碼病毒的核心蛋白；pol-編碼逆轉錄酶；env-編碼病毒的被膜糖蛋白。有的逆轉錄病毒還帶有癌基因（vonc)，即有的逆轉錄病毒有致癌作用。近年來，已設計構建成一些缺陷型病毒（defective virus)使逆轉錄病毒成為有用的基因載體，成功地把抗藥性基因轉入了人體造血前體細胞，并在細胞中表達。Hock等選用了缺失編碼病毒外殼蛋白基因的逆轉錄病毒，因此不能合成自身的外殼，但它有識別外殼蛋白進行包裝的信號（一段尚未鑒定的DNA順序)。用這種缺陷的逆轉錄病毒去感染某種細胞株，這種細胞株包含有輔助病毒（helpervirus)。輔助病毒能合成蛋白外殼，但缺失了識別蛋白外殼進行包裝的信號，因此它不能包裝成病毒顆粒。當用逆轉錄病毒感染細胞株后，逆轉錄病毒的RNA進入輔助病毒的外殼蛋白，成為病毒顆粒。這時把受感染的細胞同骨髓細胞一起培養(yǎng)，包裝在輔助病毒外殼蛋白中的逆轉錄病毒RNA，進入骨髓細胞，病毒DNA插入宿主細胞基因組，基因的活性得到表達。這時，由于骨髓細胞里面沒有輔助病毒，所以整合進宿主基因組的逆轉錄病毒，不再有外殼蛋白可供包裝，因此也就無法增殖，而只能被“陷”在宿主基因組中，通過細胞分裂而傳給下一代子細胞。

三、柯斯質粒

1978年Collins和Hohn構建一種新型的大腸桿菌克隆載體，命名為cosmid（柯斯質粒)。它是用正常的質粒同噬菌體λ的cos位點構成。例如，柯斯質粒pHC79系由質粒pBR322和噬菌體λ的cos位點的一段DNA構成（圖23-5)，全長43.kb。在包裝時，cos位點打開而產(chǎn)生噬菌體λ的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性兩個標記。圖23-5說明了克隆基因時有用的限制酶切點。所以可以說柯斯質粒是一類特殊的重組質粒。

圖23-5　柯斯質粒pHC₇₉

設計構建的柯斯質粒一般長4～6kb。其上的cos位點的一個重要作用是識別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點的任何DNA分子只要在長度相當于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結合而被包裝成類似噬菌體λ的顆粒。因此，插入柯斯質粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質粒可象噬菌體λ一樣感染大腸桿菌，并在細菌細胞中復制。如把宿主菌在含氯霉素的培養(yǎng)基中生長，柯斯質�？梢詳U增到宿主細胞DNA總量的50%左右。

采用柯斯質粒作載體的困難是：①載體自身只相當于可以插入片段的1/10左右，因此往往會出現(xiàn)載體同載體自身連接，結果在一個重組分子內(nèi)可有幾個柯斯質粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個載體分子，結果使在基因組內(nèi)本來不是相鄰的片段錯亂地連接成一個片段，會影響實驗結果的分析，后來專門選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時，每個載體只可能插入一個外源片段，因為如果二處片段，則將超過包裝成噬菌體顆粒的限度；③細菌的菌落體積遠大于噬菌斑，因此如用柯斯質粒制備基因文庫，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費時間�，F(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質粒制成的基因文庫常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源DNA有可能通過同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。

現(xiàn)將上面提到的四種載體作一比較（表23-3)

表23-3 四種載體的比較

* 外源DNA如超過10kb，則重組質粒的轉化率和DNA得率都非常低

** 已有個別質料可用于此目的

四、其他載體

現(xiàn)在提到的分子載體有的不是用于克隆某基因，而是作為外源基因進入受體細胞的運載工具。

（一)轉座子載體

這里主要提一下有關果蠅轉座因子（P因子)作為基因載體。因為這是很有希望的真核生物基因工程的載體，果蠅的P因子約長3kb，每端各有反向重復順序，當它插入基因組時，可以激活或滅活近旁的基因，當它從基因組上切下來時，也可能把近旁的基因或DNA順序一起切下而引起突變�，F(xiàn)在已能把帶有某種限制酶切點的P因子克隆到質粒pBR322中，然后在P因子酶切點上插入外源DNA。經(jīng)過擴增后，將這種重組DNA用微量注射儀直接注入果蠅的受精卵中。結果所克隆的基因能隨P因子插入受體細胞的基因里，并且得到表達。

（二)人工微小染色體

包括人體在內(nèi)的高等生物基因工程中遇到的一個難題是缺乏合適的基因載體。要求載體對受體細胞沒有危害，能安全、穩(wěn)定地轉給后代，使基因的性狀得到連續(xù)的表達。這對校正某種遺傳缺陷或改進某種性狀都是十分有用的。目前一些實驗室正致力于構建人工微小染色體（microchromosome)。

構建染色體應包括：基因、復制起點、著絲粒和端粒。染色體上需帶有基因是不言而喻的。復制起點是染色體復制所不可缺少的。著絲粒保證復制后的染色體均等地分配到兩個子細胞中。端粒具有某種特定結構以保證染色體的個體性。

首先，構建的是酵母的人工微小染色體。天然的酵母染色體為150～1000kb。人工構建的微小染色體長55kb，在細胞內(nèi)很穩(wěn)定，只是每個細胞里的拷貝數(shù)很少。比如已構成的人工微小染色體為7～15kb，每個細胞里的拷貝數(shù)雖然增多，但不夠穩(wěn)定。

人工構建酵母微小染色體的具體步驟見圖23-6。從圖中可以看到，先用質粒pBR322為材料，連接酵母的標記基因Leu2（亮氨酸)后去轉化大腸桿菌，然后再接上酵母染色體上分離得到的著絲粒CEN3，再去轉化大腸桿菌以增殖重組質粒，取得下一步實驗用的DNA。接下去是連接從酵母（真核生物)中分離得到的ARS1。ARS是指自主復制順序（autonomouslyreplicat－ing sequence)，這個順序中可能包含著復制起點。目前已從非洲爪蟾的線粒DNA，衣藻和煙草葉綠體和核DNA中分離ARS。最后一個步驟是接上染色體端粒。用的是四膜蟲（Te－trahymena)的rDNA末端（Tr末端)。這樣構建成的質粒去轉化酵母細胞后，在細胞內(nèi)斷開成為線狀重組DNA分子，可以象天然染色體一樣地復制和分離，這就是酵母線狀質粒YLp4。

圖23-6　構建酵母人工微小染色體的步驟