實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第三節(jié)　DNA重組實(shí)驗(yàn)中常用的技術(shù)

一、質(zhì)粒DNA的提取及鑒定

（一)質(zhì)粒DNA的提取及鑒定

1．

（1)將2ml含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基加入到通氣良好的15ml的試管中，接入一單菌落，于37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。

（2)將1.5ml培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，用臺(tái)式離心機(jī)于4℃以12000g離心5min，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。

（3)吸盡培養(yǎng)液，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。

2．堿裂解法小量抽提質(zhì)粒

（1)將細(xì)菌沉淀[上述步驟（3)所得]重懸于100μl預(yù)冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/lTris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中，劇烈振蕩。

（2)加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS)，緩和振蕩，水浴5min。

（3)加150μl預(yù)冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)，緩和振蕩，冰浴5min。

（4)4℃以12000g離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

（5)可作不可作：加等量飽和酚，氯仿，振蕩混勻，重復(fù)2，（4)。

（6)用2倍體積無水乙醇室溫沉淀雙鏈DNA，振蕩混合，于室溫放置2min。

（7)4℃以12000g離心5min。

（8)小心吸盡上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，再將附于管壁的液滴除盡。

（9)用75%乙醇于4℃洗滌DNA，同上離心去上清真空抽干。

（10)加50μl的1×TE（含20μg/ml無DNA酶的胰RNA酶)，振蕩，貯存于-20℃。

（二)質(zhì)粒DNA的大量制備

（1)同上1.（1)

（2)將1ml含菌液倒入含相應(yīng)抗生素的Lb 100ml中，37℃振蕩培養(yǎng)至A₅₉₀=1.0(5～6h)。

（3)加氯霉素（170μg/ml)擴(kuò)增，37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。

（4)收集菌液于離心管中，冰浴10min。3000rpm,離心10min，去上清。

（5)加溶液Ⅰ5ml懸浮菌體，將懸液倒入高速離心管中，搖勻，冰浴5min。

（6)加溶液Ⅱ10ml輕輕混勻，室溫下5min。

（7)加溶液Ⅲ7.5ml輕輕混勻，冰浴30min。15000rpm，4℃離心20min。

（8)取上清液于高速離心管中，加2倍體積的無水乙醇，混勻，入-20℃3～5h。

（9)15000rpm4℃ 離心20min。

（10)棄上清，將離心管倒放入真空泵中抽干（10～15min)。

（11)用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于過夜。

（12)加入5ml飽和酚，混勻，4000～5000rpm離心5min，取上清液入5ml離心管內(nèi)。

（13)分別加入2.5ml飽和酚，2.5ml氯仿，混勻后同樣離心收集上清。

（14)加等體積氯仿/異戊醇（24：1)混勻，同樣離心收集上清。

（15)加入1/10體積的3mol/l NaAc及2倍體積的無水乙醇于-20℃3～5h。

（16)10000rpm4℃離心20min。

（17)棄上清，加入75%乙醇洗滌2次。

（18)離心棄上清，真空抽干，加入適量1×TE溶解質(zhì)粒DNA。

（三)質(zhì)粒DNA的鑒定

1．酶切反應(yīng)

（1)在0.5mlEppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer1μl，DNA 2μl，酶1μl，混勻，37℃水浴1h以上。

（2)取反應(yīng)物點(diǎn)樣，觀察酶切效果。

（3)酶切完全后，70℃5min終止反應(yīng)。

2．瓊脂糖電泳

（1)配制所需濃度瓊脂糖凝膠。

（2)在待測(cè)的DNA樣品中加1/5體積的溴酚藍(lán)指示劑，混勻后點(diǎn)樣。

（3)打開電源開關(guān)，5V/cm電泳。

（4)在UV燈下觀察電泳結(jié)果。

二、DNA的重組

（一)DNA的酶切與連接

（1)酶切反應(yīng)

同質(zhì)粒DNA的鑒定，只不過是質(zhì)粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。

（2)加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。

（3)15000rpm離心15min，棄上清。

（4)加入75%乙醇洗滌2次，離心棄上清，真空抽干。

（5)加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。

（6)測(cè)定DNA的含量。

（7)加入線性載體DNA和含量3～4倍于載體的待插入DNA片段，連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl，在12～14℃反應(yīng)12～16h。

（8)連接反應(yīng)液可置-20℃保存，供轉(zhuǎn)化用。

（9)關(guān)于待插入DNA片段的獲得參見附注。

（二)大腸桿菌感受態(tài)的制備及重組DNA的轉(zhuǎn)化

1．感受態(tài)的制備

（1)接種單菌落于2mlLB培養(yǎng)液中， 37℃過夜。

（2)取0.25ml過夜菌入25ml LB培養(yǎng)液中，37℃振搖4～6h至A₅₉₀=0.4～0.6。

（3)倒入50ml管內(nèi)，水浴10min，以2500～3000rpm離心5min，棄上清。

（4)緩慢加入75mmol/L預(yù)冷CaCl₂5ml懸浮菌體，冰浴20min，同上離心棄上清。

（5)緩慢加入75mmol/L預(yù)冷CaCl₂1.0ml輕輕混勻后分裝在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

2．重組DNA的轉(zhuǎn)化

（1)將3只Eppendorf管按下列轉(zhuǎn)化項(xiàng)目作好標(biāo)記，然后按下述進(jìn)行：

（2)冰浴30min至1h。中間搖動(dòng)3次，以防受體菌沉底。

（3)42℃90s。

（4)37℃水浴5min。

（5)加入無相應(yīng)抗生素的Lb200μl，混勻后，37℃水浴30～60min。

（6)分別取3組反應(yīng)物各50μl在含相應(yīng)抗生素的固體LB培養(yǎng)基平皿上涂布，室溫下干燥，然后倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。

（三)轉(zhuǎn)化子DNA的快速鑒定－快速細(xì)胞破碎法

（1)挑取轉(zhuǎn)化平板上的單菌接種于含相應(yīng)抗生素的2ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)至A₅₉₀值為0.6～0.8。

（2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm離心9min，去盡上清。

（3)加入70μlCracking Gel緩沖液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚藍(lán)1.67ml，加雙蒸水至200ml]，混勻后，37℃水浴30min以上。

（4)15000rpm離心15min。

（5)吸取上清點(diǎn)樣電泳，觀察。

（四)轉(zhuǎn)化子DNA的酶切鑒定

1．轉(zhuǎn)化子DNA的快速少量抽提

（1)同本節(jié)　二.（三).1.

（2)菌液移至5mlEppendorf 管中，9000rpm,離心9min，去上清。

（3)加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混勻，冰浴10min。

（4)15000rpm離心15min。

（5)吸取上清，加入異丙醇1ml混勻，置室溫15～30min。

（6)15000rpm離心15min，棄上清，加入75%乙醇洗滌2次。

（7)離心棄上清，真空抽干，加入適量1×TE溶解DNA。

（8)取少量DNA電泳，觀察濃度。

2．轉(zhuǎn)化子DNA的小量酶切鑒定同質(zhì)粒DNA的小量酶切鑒定，見本節(jié)　一（三)。

（五)重組子DNA的進(jìn)一步鑒定

可用Southern印跡雜交法或斑點(diǎn)雜交法等進(jìn)一步鑒定，詳見本節(jié)　四。

[附]電泳洗脫法回收酶切DNA片段

（1)用合適的酶切割DNA并電泳。

（2)于紫外燈下從凝膠上切下所要的DNA帶，裝入含1×TBE緩沖液的透析代內(nèi)，用夾子封好袋口，并檢查有無漏孔。

（3)將透析袋（縱長(zhǎng))與兩極間的邊線垂直放于電泳槽內(nèi)電泳，4～5V/cm電泳至DNA貼緊袋壁。

（4)取出透析袋，擠出凝膠塊，吸出袋內(nèi)液體放入1.5ml的離心管內(nèi)，10000rpm離心5min。

（5)吸出上清放入離心管內(nèi)，加入等體積的飽和酚和等體積的氯仿，振蕩混勻，10000rpm離心5min，吸出上清放入新的離心管內(nèi)。

（6)加入1/10體積的3mol/L AaAc,2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，于-20℃放置4～5h。

（7)于4℃，10000rpm離心15min，棄上清。

（8)用75%的酒精洗滌2次，每次均于4℃，10000rpm離心5min，棄上清。

（9)真空抽干，并用適量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。

三、地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針法

（一)概述

基因診斷是以核酸分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)，在核酸水平檢測(cè)人類遺傳性疾病的基因缺陷和一些傳染病病原體的方法。其基本過程是：制備DNA探針，標(biāo)記探針，檢測(cè)樣本。開展這項(xiàng)工作的關(guān)鍵是要得到高靈敏度、高特異性的探針。以往人們是用放射性同位素來標(biāo)記探針DNA。近年來，非同位素標(biāo)記方法發(fā)展很快，已有取代同位素標(biāo)記法的趨勢(shì)。地高辛配基隨機(jī)標(biāo)記DNA探針法，是較為成功的一種非同位素標(biāo)記方法。其原理是：用化學(xué)方法把類固醇類半抗原地高辛分子連接在dUTP上（Dig-dUTP)。用隨機(jī)引物及DNA多聚酶，以探針DNA為模板，合成互補(bǔ)DNA，化學(xué)修飾過的dUTP同時(shí)摻入到標(biāo)記的DNA探針中。雜交后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛單抗與標(biāo)記探針DNA中的Dig-dUTP結(jié)合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉(zhuǎn)變成深棕色或藍(lán)色的化合物。

1．標(biāo)記　本試劑盒采用隨機(jī)引物標(biāo)記方法，可標(biāo)記少至10ng，多至3μg的DNA。能在新合成的DNA鏈每20～25個(gè)核苷酸，摻入一個(gè)Dig-dUTP，反應(yīng)時(shí)間約為1h。

2．雜交　按標(biāo)準(zhǔn)雜交方法進(jìn)行�？梢圆捎媚猃埬せ蛳跛崂w維素膜。用過的雜交液可凍存于-20℃，重復(fù)使用。

3．免疫學(xué)檢測(cè)　封阻后，檢測(cè)反應(yīng)的第一步，抗體結(jié)合物與標(biāo)記DNA結(jié)合，出現(xiàn)雜交的半抗原-標(biāo)記DNA，顯色反應(yīng)起始是在堿性pH條件下加入無色的顯色劑X-磷酸鹽和NBT，在幾分鐘內(nèi)便開始出現(xiàn)藍(lán)色，顯色反應(yīng)的過程持續(xù)3d。典型的例子是在24h后終止顯色反應(yīng)。用二甲基甲酰胺洗掉尼龍膜上的顏色后，尼龍膜可重新用于雜交。

4．應(yīng)用　地高辛配基標(biāo)記DNA探針及檢測(cè)試劑盒，能檢測(cè)0.1pg的同源DNA，能檢測(cè)1μg哺乳動(dòng)物DAN中的單拷貝基因，與放射性標(biāo)記系統(tǒng)比較，此試劑盒能快速得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果（從DNA的標(biāo)記和雜交至見到檢測(cè)結(jié)果24h內(nèi)能完成)，而且消除了放射性的不安全問題。這試劑的靈敏度與特異性使它適用于所有的雜交技術(shù)（包括DNA-印跡轉(zhuǎn)移，菌落雜交，噬菌斑雜交及原位雜交)以替代同位素標(biāo)記和放射自顯影術(shù)。

（二)試劑盒成份

1．無標(biāo)記對(duì)照DNA1　此管內(nèi)有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分別用BamHⅠ,BglⅠtHinfⅠ消化，它們的混合比例為2：3：3，共有16個(gè)Pbr328片段，這些片段的大小分別為：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220和154×2bp。

2．無標(biāo)記對(duì)照DNA2　此管內(nèi)有20μl pBR328 DNA200μg/ml，已用EcoRⅠ線性化。

3．DNA稀釋緩沖液　有兩管，每管1ml[成分為：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]內(nèi)含鮭魚精DNA（50μg/ml)。

4．標(biāo)記對(duì)照DNA　此管內(nèi)有50μl線性化pBR328DNA，按標(biāo)記方法已標(biāo)記有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA，每毫升含5μg合成的標(biāo)記DNA。

5．六聚核苷酸混合物

6．標(biāo)記用混合底物　此管內(nèi)有50μl10倍濃度的dNTP標(biāo)記用混合底物，含dATP（1mmol/L)dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。

7．DNA聚合酶Ⅰ大片段（標(biāo)記級(jí))　此管內(nèi)有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow)，2^U/μl。

8．（Dig)AP結(jié)合物　此管內(nèi)有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，結(jié)合有堿性磷酸酶750U/ml。

9．NBT　有兩管，每管1.25ml，是溶于70%（V/V)二甲基甲酰胺的硝基藍(lán)四唑鹽溶液（75mg/ml)。

10．X-磷酸鹽　有兩管，每管0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺的5jfsoft.net.cn/sanji/-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽的甲苯胺溶液（50mg/ml)。

11．封阻試劑　有兩瓶，每瓶有50g粉劑。

（三)需配制的溶液

EDTA（0.2mol/L),pH8.0(20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED－TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸鈉鹽；10%（V/V)SDS；20×SSC：3mol/l NaCl;0.3mol/L檸檬酸三鈉；pH7.0Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris–HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。

（四)操作方法

1．標(biāo)記DNA探針　每次標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)可標(biāo)記10ng至3μg線性的DNA，也可標(biāo)記更大量的DNA，但所有的成分和體積要相應(yīng)增加。

（1)DNA探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。

（2)取Eppendorf管（1.5ml)置于冰上，加下列及試劑：

新鮮變性的DNA 1-3μg

六聚核苷酸混合物 2μl（管5)

dNTP標(biāo)記用混合底物 　2μl（管6)

加無菌重蒸水至　 19μl

DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow)　1μl（管7)

（3)在37℃保溫至少60min，可到20h。

（4)煮沸5min，終止反應(yīng)。

（5)15000rpm離心30s，置于冰上待用。

2．預(yù)雜交　按100cm²膜用20～40ml預(yù)雜交溶液，預(yù)雜交時(shí)使溶液處于流動(dòng)狀態(tài)。

預(yù)雜交液組成：5×SSC

0.5%（W/V)封阻試劑（管11)

0.1%（W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉

0.02%（W/V)SDS

膜放入塑料袋，灌入預(yù)雜交液，排除氣體后密封，在65℃預(yù)雜交過夜。

3．雜交　按100cm2膜用2.5ml雜交液，雜交時(shí)偶爾搖動(dòng)雜交袋，使里面的溶液重新分配。

雜交液組成： 50%甲酰胺（V/V)

5%（W/V)封阻試劑

5×SSC

0.1（W/V)N-十二烷酰肌氨酸鈉

0．02%(W/V)SDS

新變性標(biāo)記DNA（150ng/ml)

雜交液取代預(yù)雜交液，替換間膜不能干，成功地替換應(yīng)是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜（16～20h)。

4．洗膜按100cm²膜用250ml洗膜液計(jì)算。

（1)在室溫下用2×SSC/0.1%（W/V)SDS溶液漂洗，5min，2次。

（2)在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。

（3)在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。

5．免疫測(cè)定

（1)配制溶液

緩沖液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃)

緩沖液2：0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會(huì)快速溶解,因此應(yīng)預(yù)早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁)。

緩沖液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI₂(500mmol/L)pH9.5(20℃)。

緩沖液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃)

顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45μlNBT溶液（管9)和35μlX-磷酸鹽緩沖液（管10)。

2． 顯色過程

A．膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min)。

B．在100ml緩沖2中保溫30min。

C．再用緩沖液1短暫洗滌。

D.用緩沖液1稀釋的抗體結(jié)合物(管8)至150^U/L(1:5000);稀釋后的抗體結(jié)合物在4℃只能穩(wěn)定12h。

E.膜在20ml稀釋的抗體結(jié)合物溶液中保溫30min。

F.用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結(jié)合的抗體結(jié)合物,15min,2次。

G.膜在緩沖液3中平衡2min。

H.在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內(nèi)密封或放入合適的盒子內(nèi),幾分鐘內(nèi)開始出現(xiàn)顏色,一般顯色反應(yīng)在1天后全部完成。當(dāng)顏色顯影時(shí)，不可振蕩或攪拌。

I．當(dāng)要求的點(diǎn)或帶已被檢測(cè)時(shí)，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應(yīng)。

J．?dāng)z相。

說明：上述各反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行，除了顯色反應(yīng)外，均需振蕩或攪拌。

（五)排除實(shí)驗(yàn)中問題的方法

1．DNA不能有效地被標(biāo)記時(shí)考慮

（1)用酚/氯仿抽提和/或乙醇沉淀，重新純化DNA。

（2)標(biāo)記反應(yīng)的保溫時(shí)間延長(zhǎng)（增至20h)。

（3)DNA變性或許不完全，這時(shí)對(duì)大片段DNA特別重要。

2．不能達(dá)到預(yù)期的靈敏度時(shí)考慮

（1)DNA標(biāo)記率。

（2)增加標(biāo)記DNA的濃度或增加雜交時(shí)間。

（3)顯色反應(yīng)的時(shí)間可延長(zhǎng)至3d。

3．若顯色時(shí)背景過深，可采取

（1)在雜交溶液中減少標(biāo)記DNA量。

（2)增加雜交溶液的體積，使膜隨意漂浮在溶液中。

（3)某些類型的尼龍膜可能產(chǎn)生深色背景，因此可采用其它類型的尼龍膜或改用硝酸纖維素膜。

（4)在雜交和檢測(cè)過程中增加封阻試劑的濃度。

四、核酸的分子雜交

核酸分子的固相雜交是將待測(cè)核酸樣品結(jié)合在某種固相支持物上，然后與溶液中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纖維膜。這里重點(diǎn)介紹直接點(diǎn)樣技術(shù)，轉(zhuǎn)移技術(shù)及其它常用的雜交技術(shù)。

（一)斑點(diǎn)雜交的直接點(diǎn)樣法

斑點(diǎn)雜交或叫打點(diǎn)雜交（dot-blot hybridization)，其主要特點(diǎn)是事先不用限制內(nèi)切酶消化或用凝膠電泳分離核酸樣品，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。一個(gè)點(diǎn)樣品只含0.25～1pg的DNA也能檢測(cè)到。但不知道雜交片段的大�。▔A基對(duì)數(shù))。

1．DNA的打點(diǎn)法（DNa Dot Blot)

（1)膜的處理：戴上干凈手套，取出硝酸纖維膜，按需要剪成一定大小，量好各樣點(diǎn)間距離，用軟鉛筆標(biāo)記。

（2)DNA變性：將DNA溶液于1×TE（pH8.0)緩沖液中或蒸餾水中，取一定量DNA樣品加于小塑料管中，在100℃沸水中煮10min，迅速入冰水中。

（3)點(diǎn)樣：用塑料或硅化玻璃或微量加樣器取1～5μl變性DNA，將滴管放在硝酸纖維膜上，使DNA慢慢吸在濾膜上，點(diǎn)樣完后涼干。

（4)固定：將涼干的濾膜夾在濾紙中，于80℃干烤2～3h，然后進(jìn)行雜交。

2．RNA的打點(diǎn)法（RNa Dot Blot)

（1)膜的處理：同DNA的打點(diǎn)法。

（2)RNA變性：將提取的RNA與50μl 20×SSC/甲醛（30μl20×SSC加20μl甲醛)混合，65℃水浴15min。

（3)點(diǎn)樣：同DNA的打點(diǎn)法。

（4)固定：同DNA的打點(diǎn)法。

（二)DNA的吸印轉(zhuǎn)移法（Southern Blot)

DNA經(jīng)過限制性內(nèi)切酶消化和凝膠電泳后，放入堿性溶液中使其變性，將變性后的單鏈DNA從凝膠中按原來位置和順序用濾紙吸印轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后再與標(biāo)記探針雜交。此方法比較準(zhǔn)確地保持了特異DNA序列在電泳圖譜中的位置，而且能測(cè)定分子量。

試劑：變性液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl

中和液：1mol/l Tris-HCl, 1.5mol/L NaClpH8.0

20×SSC:0.3mol/L檸檬酸鈉，3mol/l NaCl

1．電泳　取DNA約5μg加限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，電泳鑒定酶切完全后，取酶消化后的DNA點(diǎn)樣于0.8%～1.2%的凝膠上，以0.8～1V/cm電壓電泳過夜，在溴酚藍(lán)離凝膠前緣0.5cm處停止電泳。將電泳后的凝膠翻轉(zhuǎn)，紫外燈照射10～20min后拍照。

2．變性與中和　將電泳后的凝膠放入變性液中25℃振蕩60min。蒸餾水洗膠1min，將凝膠放入中和液中25℃振蕩60min。

3．轉(zhuǎn)移　取托盤一只，放入10×SSC溶液約500～1000ml，托盤上搭一塊比凝膠稍寬的長(zhǎng)方形玻璃，取一長(zhǎng)方形Wateman paper（濾紙)搭在橋上，兩邊浸入10×SSC溶液中，仔細(xì)去掉玻璃與濾紙之間的氣泡（用玻棒在濾紙上滾動(dòng))。將凝膠放在濾紙上，去掉凝膠與濾紙之間的氣泡。將硝酸纖維膜放入2×SSC溶液中浸濕后放在凝膠上（如NC膜浸濕不均勻，則考慮更換NC膜，操作時(shí)手切勿觸及NC膜)，去掉凝膠與NC膜之間的氣泡。將一張濾紙（長(zhǎng)和寬均比NC膜小1mm)放在NC膜上，仔細(xì)去掉氣泡。將吸水紙切成與濾紙大小，重疊放在濾紙上，再壓一重物約500～1000g。轉(zhuǎn)膜24h，中間更換吸水紙。

圖23-7　Southern轉(zhuǎn)膜示意圖

4．固定用2×SSC溶液洗膜5min去掉殘余凝膠，讓膜自然涼干。將凝膠放入EB液中30min，取出在UV燈下觀察是否有DNA殘余。80℃烤膜2h，然后將膜封入塑料袋進(jìn)行雜交。

（三)RNA的吸印轉(zhuǎn)移法（Northern blot)

在RNA凝膠電泳之前，先用乙二醛等變性劑處理RNA，再在適宜條件下電泳使充分變性的RNA直接吸印到硝酸纖維膜上。固定后除去變性劑，然后進(jìn)行雜交。

試劑：

乙二醛：4mol/L（約為30%)，經(jīng)過陰陽(yáng)離子交換樹脂純化，使pH為5.5～6.0

磷酸緩沖液：80mmol/L pH6.5～7.0

磷酸緩沖液：10mmol/L pH6.5～7.0

Tris-HCl:20mmol/L pH7.8

二甲基亞砜：分析純

20×SSC：0.3mol/L檸檬酸鈉，3mol/l NaCl

1.RNA變性　吸取1μl 80mmol/L磷酸緩沖液，1μl RNA樣品（最多100μg)，2μl，4mol/l 乙二醇，4μl二甲基亞砜。混勻后，50℃水浴1h，然后放入冰中。

2．電泳　變性結(jié)束后，加入含有50%甘油的10mmol/L磷酸緩沖液2μl和少量溴酚藍(lán)，混勻后點(diǎn)樣于1.0%的凝膠上，以4～5V/cm電壓電泳。凝膠電泳液為10mmol/L磷酸緩沖液，pH6.5～7.0。

3．轉(zhuǎn)移　變性處理后的RNA可以轉(zhuǎn)移并結(jié)合到硝酸纖維膜上，轉(zhuǎn)移過程和轉(zhuǎn)移變性與DNA相同。

4．固定　用20×SSC轉(zhuǎn)移RNA。膜夾在兩層干凈濾紙中涼干后，80℃烤膜2h

5．乙二醛附加物消除　RNA膜固定后，放入20mmol/l Tris-HCl中，100℃處理5～10min，去除乙二醛，然后進(jìn)行雜交。

（四)硝酸纖維膜固相雜交

核酸樣品經(jīng)過直接點(diǎn)樣或轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，固定后，可以進(jìn)行雜交反應(yīng)。在雜交溶液中，硝酸纖維膜上變性的核酸樣品和變性后的探針在一定的條件下形成雙鏈雜交核酸分子。然后進(jìn)行酶標(biāo)顯色。

試劑及操作方法見本節(jié)　三。

五、真核細(xì)胞基因組DNA的制備

從不同組織細(xì)胞或血細(xì)胞中提取DNA是進(jìn)行基因診斷的先決條件。制備DNA的原則是既要將蛋白質(zhì)、脂類、糖類等物質(zhì)分離干凈，又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K的應(yīng)用使這兩個(gè)原則得到了保證。在提取DNA的反應(yīng)體系中，SDS是離子型表面活性劑，主要作用是：（1)溶解膜蛋白而不破壞細(xì)胞膜；（2)解聚細(xì)胞中的核蛋白；（3)與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。蛋白酶K可將蛋白降解成小的多肽和氨基酸，使DNA分子盡量完整地分離出來。具體方法如下：

（一)白細(xì)胞DNA的制備

（1)采集外周靜脈血10ml，加1.7ml ACD（檸檬酸0.48g、檸檬酸鈉1.32g、葡萄糖1.47g、加水至100ml,0.6kg/cm²滅菌30min)抗凝。

（2)將血液放入已滅菌的50ml塑料離心管內(nèi)，加30mlSTMT[0.32mol/L蔗糖、10mmol/lTris-HCl(pH7.5)、5mmol/L MgCl₂、1%Triton –X 100]，輕輕上下振蕩至透明，紅細(xì)胞完全溶解。

（3)冰浴10min，離心，3000rpm，10min。棄上清，STMT重復(fù)處理1～3次。

（4)棄上清，白色沉淀物加10mlSTE[0.1mol/L NaCl、10mmol/l Tris-HCl(pH8.0)、1mmol/L EDTA(pH8.0)]，先少量，充分混勻，然后加10mg/ml蛋白酶K100μl，20%SDS30μl，搖勻，置37℃水浴15～20h。

（5)用等體積飽和酚抽提，3000rpm離心5min。

（6)用大口鈍緣吸管小心吸取上層水相，加飽和酚和氯仿-異戊醇（24：1)抽提，3000rpm離心5min 。

（7)小心吸取上層水相，用等體積氯仿-異戊醇（24：1)，抽提，3000rpm離心5min。

（8)小心吸取上層水相，加入1/10體積3mol/l NaAc,2.5體積預(yù)冷無水乙醇混勻，-20℃過夜。

（9)將白色絮狀沉淀物用玻璃棒挑出，放入Eppendorf管內(nèi)，加1ml 75%乙醇4℃靜置1h，離心，10000rpm10min。

（10)棄上清，用蠟?zāi)�將管口封好，針刺�?shù)個(gè)小孔，真空抽提（10～15min)。jfsoft.net.cn

（11)加200μl1×TE溶解，置4℃保存。

（12)對(duì)所提DNA用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量和純度檢測(cè)。

（13)取2～4μl DNA樣品，經(jīng)瓊脂糖凝膠（Agarose)電泳，檢查所提DNA的質(zhì)量及降解情況。

（二)組織DNA的制備

（1)將200mg組織在冰浴條件下用消毒剪刀充分剪碎，加4ml 1×RSB緩沖液（10mmol/L Tris, pH7.4;10mmol/lNaCl;25mmol/L EDTA,pH7.4)放入10ml帶蓋的塑料管中。

（2)加SDS至濃度為1%（可加0.4ml10%SDS)，混勻。由于DNA從核中釋放出來，樣品變得粘稠。

（3)加10mg/ml蛋白酶k 44μl，終濃度為100μl/ml，37℃保溫1～3d，直到組織完全解體。中間可振動(dòng)樣品管幾次。加0.4ml 5mol/L NaCl。

（4)用等體積飽和酚、1/2體積飽和酚和1/2體積氯仿-異戊醇及等體積氯仿-異戊醇（24：1)各抽提一次，3000rpm離心5min，用大口鈍緣吸管小心吸取上層水相。

（5)加2.5倍體積預(yù)冷無水乙醇沉淀DNA。用一玻璃棒收集白色纖維絲狀的大片段DNA，并移入一新管，吸干DNA中的無水乙醇。

（6)DNA溶于4ml 0.1×SSC中，4℃過夜可作進(jìn)一步純化。

（7)加20μlRNase A(10mg/ml),37 ℃保溫5h。加0.4ml5mol/L NaCl。

（8)同上法用飽和酚、氯仿-異戊醇抽提，乙醇沉淀離心，棄上清。

（9)75%乙醇洗滌2次，離心，棄上清，真空抽干。適量1×TE溶解，保存在4℃。

六、轉(zhuǎn)移基因

最常用的將克隆重組的DNA片段導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法是用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的DNA可能是通過吞飲作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后進(jìn)行細(xì)胞核。

（1)配制下列溶液

①2×HEPES-緩沖鹽溶液（HBS)

②2mol/L CaCl₂

③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm濾器過濾除菌，分裝貯存于4℃。

④DNA：將DNA（約20μg/10⁶細(xì)胞)溶于0.1×TE（pH8.0)，使用濃度為40μg/ml。為使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，質(zhì)粒DNA應(yīng)用CsCl-溴化乙錠密度梯度平衡離心法純化。如果所用DNA量較少，應(yīng)加入載體DNA將DNA濃度調(diào)至40μg/ml。實(shí)驗(yàn)室制備的真核載體DNA轉(zhuǎn)染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鮭魚精DNA高。載體DNA用前應(yīng)通過乙醇沉淀或氯仿抽提進(jìn)行滅菌。

（2)轉(zhuǎn)染前24h用胰蛋白酶進(jìn)行消化以獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1～2×10⁵細(xì)胞/cm²的密度重新種入60mm組織培養(yǎng)皿中。在37℃、5%～7%CO₂及一定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～24h。

（3)每轉(zhuǎn)染一個(gè)60mm培養(yǎng)皿中的單層細(xì)胞，須依如下方法制備磷酸鈣-DNA共沉淀物：取步驟一所制備的DNA[40μg/ml，溶于0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的滅菌5ml塑料管中，緩慢加入31μl 2mol/l 氯化鈣（溫和混合30s左右)。于室溫育20～30min，其間將形成細(xì)小沉淀。溫育結(jié)束時(shí)，用吸管將混合液吹打一次，使沉淀物懸浮。

通常采用的另一方案是將氯化鈣和DNA的稀釋混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入并小心混合250μl按步驟一制備并溶于氯化鈣（250mmol/L)的DNA。按照前述方法溫育之。

如果需要轉(zhuǎn)染更為大量的細(xì)胞，上述兩種反應(yīng)混合液的體積均可翻一番或翻兩番。如果體積翻兩番，則須使用更大的塑料管，一般在25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，可將0.5ml磷酸鈣-DNA共沉淀物加入5ml培養(yǎng)液中，而在90mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，一般將1ml沉淀物加入10ml培養(yǎng)液中。

已經(jīng)發(fā)表的方案中，混合各組分的方式與速率大不相同。其中有一些認(rèn)為除了溫和振搖之外，其它措施均無濟(jì)于事，并建議用電動(dòng)移液裝置吹出的空氣來混合溶液。其它一些方案則規(guī)勸在加入DNA溶液時(shí)連續(xù)而緩慢地混勻，然后再溫和振蕩。其目的是為了避免急速形成粗沉淀物，以致降低轉(zhuǎn)化效率。實(shí)際上，除了混合的速度之外，還有其它若干因素包括DNA的濃度和大�。ㄗ尭叻肿恿緿NA從細(xì)針頭中通過，可將之剪切變小)、緩沖液的精確pH（有些工作者配制了幾批pH范圍從6.95至7.1不等的HBS緩沖液，逐批試驗(yàn)沉淀物的質(zhì)量及轉(zhuǎn)染效率)。如果必須使轉(zhuǎn)染效率達(dá)到最高，就要花時(shí)間針對(duì)特定的系統(tǒng)優(yōu)化上述幾種因素。一旦得到一批靈驗(yàn)的試劑，只需依照前面方法進(jìn)行配制和貯存，即可在長(zhǎng)期內(nèi)獲得可重復(fù)的結(jié)果。

（4)將磷酸鈣-DNA懸液轉(zhuǎn)移至細(xì)胞單層上的培養(yǎng)液中[在60mm培養(yǎng)皿中，可將0.5ml懸液加入5ml培養(yǎng)液中]，輕輕左右晃動(dòng)一下培養(yǎng)皿使培養(yǎng)液得以混合，此時(shí)可見培養(yǎng)液成黃橙色渾濁狀。另一方法是吸出培養(yǎng)液，直接把沉淀物加到細(xì)胞上，將細(xì)胞置于室溫溫育15min，然后再將培養(yǎng)液加回到培養(yǎng)皿中，此時(shí)細(xì)胞上有許多細(xì)小顆粒。采用以上兩種方法，都要在37℃、5%～7%CO₂及一定濕度的培養(yǎng)箱中將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)24h[時(shí)間的長(zhǎng)短取決于后續(xù)處理步驟的不同，見步驟（5)]。

（5)然后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可依以下任一種方法處理：

①如果不進(jìn)行其它處理（如用氯喹、甘油或丁酸鈉等試劑處理，見后)，可在細(xì)胞培養(yǎng)16～24h后，吸出培養(yǎng)液和沉淀物，用PBS將單層細(xì)胞再洗一次。然后按下述③d操作。

②在許多情況下，同時(shí)用氯喹處理細(xì)胞，可提高DNA攝入率。氯喹可能是通過抑制溶酶體水解酶類對(duì)DNA的降解而起作用的。氯喹濃度及其處理時(shí)間不能超越細(xì)胞對(duì)其毒性作用的耐受能力。因此必須通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來決定適于所用特定型別細(xì)胞的最佳氯喹濃度。但對(duì)于大部分型別的細(xì)胞，用終濃度為100μmol/L的氯喹處理3～5h，都可取得良好效果。可在磷酸鈣-DNA共沉淀物加入細(xì)胞之前或之后（見步驟（4)介紹的其它方法)，直接將氯喹二磷酸貯存液（過濾除菌并貯于-20℃用金屬泊密封的管中，100mmol/L)稀釋（1：100)于培養(yǎng)液中。在氯喹處理過程中，細(xì)胞呈現(xiàn)泡狀是正常的。經(jīng)用DNA和氯喹處理3～5h后，棄去培養(yǎng)液和沉淀，用PBS洗，然后按下述d操作。

③用甘油短暫處理細(xì)胞，同樣可提高轉(zhuǎn)化效率或?qū)�入DNA的瞬時(shí)表達(dá)水平。這一步驟可以在氯喹處理之后進(jìn)行。由于不同細(xì)胞對(duì)甘油的毒性作用的敏感性相差懸殊，因此每種型別的細(xì)胞都必須通過預(yù)實(shí)驗(yàn)決定最佳處理時(shí)間（從30s至3min)。耐受甘油的細(xì)胞可以暴露于含磷酸鈣-DNA共沉淀物（含或不含氯喹)的生長(zhǎng)液3～5h后進(jìn)行休克。

a. 吸出生長(zhǎng)液，用PBS將單層細(xì)胞洗1次；

b.在單層細(xì)胞中加入1.5ml溶于1×HBS的15%甘油，在37℃培養(yǎng)0.5～3min；

c.吸出甘油，用PBS將單層細(xì)胞洗1次；

d.加入5ml預(yù)加溫的完全生長(zhǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24～60h后，檢測(cè)DNA的瞬時(shí)表達(dá)或?qū)⒓?xì)胞重新種入適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中，分離穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。

④業(yè)以表明，丁酸鈉也可以在猴源和人源細(xì)胞中增強(qiáng)帶SV40早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的重組質(zhì)粒的表達(dá)�？芍苯釉谏�長(zhǎng)液中加入有關(guān)試劑，也可以使經(jīng)過甘油休克的細(xì)胞接受丁酸鈉處理。須視細(xì)胞型別的不同，采用不同濃度的丁酸鈉（500mmol/L貯存液，在化學(xué)通風(fēng)櫥中用NaOH中和丁酸制備而成)，例如：

CV-110mmol/L

NIH-3T3 7mmol/L

HelaS3　5mmol/L

CHO 2mmol/L

不加完全生長(zhǎng)液，然后重復(fù)步驟d。

（6)轉(zhuǎn)移基因表達(dá)和細(xì)胞集落形成

①瞬時(shí)表達(dá)：在轉(zhuǎn)染后48～60h收獲細(xì)胞，進(jìn)行RNA或DNA雜交分析。新合成的蛋白質(zhì)可以用放射免疫測(cè)定Western印跡，體內(nèi)代謝標(biāo)記－免疫沉淀或者細(xì)胞提取液中酶活性的測(cè)定等方法來進(jìn)行分析，如果測(cè)定中有重復(fù)品或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞要經(jīng)過多種不同條件或在一段時(shí)間歷程以內(nèi)取不同時(shí)間進(jìn)行處理，就要避免皿與培養(yǎng)皿之間轉(zhuǎn)染效率的偏差。在這些情況下，最好轉(zhuǎn)染大片的單層細(xì)胞（90mm培養(yǎng)皿)，培養(yǎng)24h后用胰蛋白酶進(jìn)行消化，再分接到若干較小的培養(yǎng)皿上。

②穩(wěn)定轉(zhuǎn)化：在非選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24h，使所轉(zhuǎn)移基因得到表達(dá)之后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，種入適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基中。這種培養(yǎng)基在2～3周內(nèi)每2～4d須更換1次，以便除去死細(xì)胞殘骸并使抗性細(xì)胞集落得以生長(zhǎng)。

可以克隆單個(gè)細(xì)胞集落，增殖后進(jìn)行測(cè)定。可以用冰預(yù)冷的甲醇將仍保留在培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞固定15min，再于室溫用10%Giemsa染色15min，最后用自來水沖洗，這樣即可得到細(xì)胞集落數(shù)的永久記錄。Giemsa染液可用PBS或水現(xiàn)用現(xiàn)配，并用Whatman 1號(hào)濾紙過濾。

重新接種細(xì)胞以便取得分隔良好的細(xì)胞集落所要求稀釋倍數(shù)，主要由穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的效率來決定。這一效率可以相差若干個(gè)數(shù)量級(jí)，它起決于：a.受體細(xì)胞的型別（即使同一細(xì)胞系，克隆不同或傳代數(shù)不同，也表現(xiàn)出顯著差異)；b.導(dǎo)入基因的特性及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)強(qiáng)弱；c.轉(zhuǎn)染中所用供體DNA的量。