Angerer及其同事們首先應(yīng)用RNA探針于原位雜交（見Cox et al 1984)，核酸探針為單鏈的RNA分子，產(chǎn)生自具有質(zhì)粒逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的cDNA克�。▓D20-2)。由于它是單鏈的，不像雙鏈的DNA探針，在溶液中不會(huì)再退火（reanneal)，因此，較大百分比的探針可參與雜交反應(yīng)，較cDNA探針的信號(hào)強(qiáng)。除此之外，在溶液中產(chǎn)生的cRNA-mRNA雜交體比相應(yīng)的cDNA-mRNA雜交體穩(wěn)定，但在原位雜交中是否如此尚未證明。cRNA探針不足之處在于有時(shí)比DNA探針粘性強(qiáng)（stickier)。可與組織產(chǎn)生較高的非特異性結(jié)合，但此缺陷可在雜交后漂洗液中加用酶漂洗來解決。最近，Wolf等（1987)建議插入確定長(zhǎng)度的寡核苷酸至載體內(nèi)產(chǎn)生cRNA分子，這種cRBA分子稱為“寡核苷酸核酸探針”（oligoribo－probes)已被成功的用于原位雜交實(shí)驗(yàn)。
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圖20-2 示cDNA轉(zhuǎn)錄為cRNA，可標(biāo)記以不同的標(biāo)記物，然后與細(xì)胞中的mRNA相結(jié)合。Biotin(生物素)，Au(金)，digo-（地高辛)
（一)組織切片的原位雜交細(xì)胞化學(xué)方法
（1)組織準(zhǔn)備：大鼠以10%水合氯醛（0.3ml/100g 體重)，或1%戊巴比妥鈉約1ml（3～4mg/100g體重)腹腔內(nèi)注射麻醉，用100ml生理鹽水沖洗和150ml 4%多聚甲醛主動(dòng)脈灌注固定。固定半小時(shí)后，取出組織塊，置入4%多聚甲醛液中后固定4～6h，4℃。
如要取腦組織，可于灌注后置4℃冰箱內(nèi)過夜，次晨取腦組織，后固定4℃4h左右。
（2)組織切片/培養(yǎng)細(xì)胞在經(jīng)過處理，抹以粘附劑的載片上，在43℃烤箱過夜。
（3)在PBS（0.1mol/l Ph7.2)中浸5～10min。
（4)浸于0.1mol/L甘氨酸—PBs 液內(nèi)5min。
（5)為增強(qiáng)組織通透性，將載片置于0.3%Triton X-100(在PBS內(nèi))10～15min。
（6)PBS洗3×5min。
（7)在蛋白激酶K（1μg/ml)溶于Tris –HCl (0.1mol/L, pH8.0)和EDTA（50mmol/L,pH8)中37℃20min。也有用蛋白激酶K溶液，不加EDTA的。
（8)浸入新鮮配制的4%多聚甲醛（在PBS0.1mokl/L,pH7.2)3min以終止消化作用和再固定。
（9)浸入新鮮配制的含0.25%（V/V)三乙醇胺（0.1mol/l pH8.0)中，10min以達(dá)乙�；╝cetylate)的目的。
（10)預(yù)雜交：在50%（V/V)甲酰胺溶于4×SSC預(yù)熱37℃15～45min 。
（11)雜交：將載片上過量的甲酰胺液傾去，加20μl雜交混合液（含放射性同位素標(biāo)記的探針量為5×103～106cpm/每張載片)。覆以硅化的蓋玻片，置于盛有少量5×SSC的硬塑料盒內(nèi)以保持濕度，42℃孵育12～18h。為使載片不致于浸泡于SSC溶液內(nèi)，通常以二根玻管（或棒)扎成擔(dān)架狀，載片置于玻棒上，與鹽液不接觸，但可保持盒內(nèi)空氣濕潤(rùn)。
（12)雜交后漂洗
①以小燒杯盛適量4×SSC溶液，將載片一端斜插入溶液內(nèi)，輕輕抖動(dòng)以移除蓋玻片。
②將載片置于有刻度的染色用小方玻缸內(nèi)，加入42℃（預(yù)熱)4×SSC，3×20min。在漂洗過程中宜不斷振動(dòng)，以增強(qiáng)漂洗效果。如設(shè)有調(diào)整鈕的振動(dòng)臺(tái)更為理想。
③加20μlRNA酶溶液（20μg/ml)在NaCl(0.5mol/L)、Tris –HCl (pH8.0)和EDTA（1mmol/L,pH8.0)消化未雜交探針，42℃30min（也有不加EDTA的)。
④以遞減梯度鹽溶液SSC漂洗載片：2×SSC，0.1×SSC和0.05×SSC各30min 42℃。
⑤梯度酒精脫水：70%，90%，2×100%酒精含0.3mol/L乙酰胺，室溫，每次10min，空氣干燥后待進(jìn)行放射自顯影。
（13)放射自顯影和復(fù)染
①在暗室中預(yù)熱水浴至45℃，將分裝的核乳膠溶液小瓶置水浴中浸泡至少1h，同時(shí)預(yù)熱一電熱板至45℃。將雜交后漂洗過完全干燥的載片依次排列于玻片架上，有組織切片一面面向?qū)嶒?yàn)者。在實(shí)驗(yàn)的載玻片前放1～2張無切片的干凈玻片，作為測(cè)定核乳膠溶解度與浸片高度等的空白對(duì)照片。浸泡（Dipping)過核乳膠膜的載片放入暗盒內(nèi)，事先最好將暗盒準(zhǔn)備好，為保持干燥，放入一包變色硅膠干燥劑（無水干燥劑為小塊藍(lán)色晶體，吸水后呈粉紅色，置烤箱中烘干待轉(zhuǎn)成藍(lán)色后可重復(fù)應(yīng)用)，預(yù)先備好封固暗盒用的膠帶備用。
②核乳膠液，國(guó)外產(chǎn)品為ILFord K5乳膠液，國(guó)內(nèi)核乳膠產(chǎn)品可自原子能研究所訂購(gòu)。不論國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口乳膠，事先應(yīng)（按說明需要濃度)稀釋分裝在10ml小瓶?jī)?nèi)，密封于暗盒內(nèi)，4℃?zhèn)溆谩７磸?fù)的冷凍和融解核乳膠會(huì)增加背景染色。每一小瓶供一次性實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。
為節(jié) 省核乳膠，切片宜貼附在靠近載片的一端。這樣，在浸泡時(shí)少量乳膠便可充分覆蓋切片。
③浸核乳膠（Dipping)：當(dāng)一切準(zhǔn)備工作就緒后，在暗室中（只留完全燈)先將載片置于電熱板上預(yù)熱1～2min。以空白載片浸入核乳膠液，取出后檢查核乳膠是否充分溶解，玻片上有無氣泡。然后正式進(jìn)行切片浸入。浸核乳膠膜是一項(xiàng)需反復(fù)操練的技術(shù)。以拇、食指夾住玻片一端，以垂直方向進(jìn)入乳膠，進(jìn)入的提出均應(yīng)采取中速度，且速度應(yīng)保持穩(wěn)定，提出后可將玻片一端滴下的乳膠輕沾于吸水紙上，掌握好該技術(shù)，浸入形成的核乳膠膜厚度適當(dāng)，均勻一致。依序放在預(yù)熱45℃的電熱板，傾斜度應(yīng)一致。在45℃電熱板上干燥至少1～2h，在此期間應(yīng)嚴(yán)格控制在黑暗中。
④裝入暗盒曝光：將載片架上已干燥覆有核乳膠的載片放入暗盒內(nèi)，周圍用膠帶封固，以標(biāo)簽寫明：樣品種類，實(shí)驗(yàn)者姓名，曝光日期等放在4℃冷房或冰箱內(nèi)。曝光時(shí)間依同位素種類而異，32P大約需5～7日，3H需4周，但還要參考細(xì)胞內(nèi)mRNA的含量而定，含量高者曝光時(shí)間宜短，反之宜適當(dāng)延長(zhǎng)�？筛鶕�(jù)不同曝光時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果予以調(diào)整。曝光時(shí)間長(zhǎng)可增加信號(hào)，但也增加背景，反之，信號(hào)減弱，但背景亦低。
⑤顯影：取出切片中暗盒（注意：切勿啟封)，放在室溫至少1h，使其回升到室溫。然后在暗室內(nèi)（只留安全燈)，將載片置入Kodax D19顯影液（預(yù)調(diào)溫至18～20℃)3min。水沖片刻后入Kodax F24固定劑內(nèi)3min。上述溶液及水溫最好都保持在18～20℃。突然改變?nèi)芤簻囟葧?huì)損壞精細(xì)的核乳膠膜。另外，在顯影和定影過程中不要振蕩溶液，因?yàn)�，這時(shí)的乳膠還是處于膠狀結(jié)構(gòu)，溶液振蕩的沖擊可使乳膠膜產(chǎn)生劃痕。
⑥沖洗，脫水和復(fù)染：用自來水（水沖力勿過猛)沖洗載片20min，如需要可用1%蘇木精復(fù)染，復(fù)染后自來水沖洗分化2min，梯度酒精脫水（70%，90%，100%)每次3min，二甲苯透明，DPX封片。
（二)培養(yǎng)細(xì)胞的原位雜交細(xì)胞化學(xué)方法
（1)固定：通常將細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片或塑料薄膜上，可將蓋玻片取出，傾去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛液固定2～4h后，依組織切片處理法進(jìn)行ISHH實(shí)驗(yàn)。也有在4%多聚甲醛室溫固定20min后，由低濃度30%，50%，70%酒精各3min ，保留在新鮮配制的70%酒精中，4℃，備用。
（2)重回到水：50%，30%酒精3min，無菌重蒸水2×3min，然后置入PBS含5mmol/l MgCl210min，室溫（配制法：200ml PBS, 1ml MgCl2)。
（3)0.1mol/L甘氨酸/Tris pH7.4：室溫10min(0.1mol/L 甘氨酸，0.2mol/l Tris（配制法：1.5mg甘氨酸和20ml Tris，應(yīng)用重蒸水制成200ml)。
以后步驟同（一)組織切片法。
（一)光敏生物素標(biāo)記cRNA探針的應(yīng)用
以線性質(zhì)粒DNA為模板合成未加標(biāo)記物的cRNA探針，使其最終濃度為0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再與等體積的光敏生物素（1μg/μl)混合。在150瓦鹵素?zé)粝拢嚯x光源20cm處照射30min。用仲丁醇抽提游離生物素，再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探針，將其溶于適量的滅菌雙蒸水，用紫外分光亮度計(jì)測(cè)探針的光密度（詳?shù)谑耪隆?，其最佳工作濃度為2μg/ml。
切片的制作、預(yù)處理、預(yù)雜交、雜交和雜交后沖洗的方法同概述中基本方法一節(jié) 。
光敏生物素核酸探針原位雜交組化程序jfsoft.net.cn/pharm/：
（1)石蠟切片脫蠟入水后，置0.1mol/l PBS pH7.2沖洗5min；冰凍切片直接入PBS沖洗5min。
（2)0.1mol/l 甘氨酸PBS沖洗5min。
（3)0.4%Trition X-100 PBS 沖洗15min。
（4)蛋白酶K1μg/ml（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配)37℃保溫30min。
（5)4%多聚甲醛PBS固定5min。
（6)0.1mol/l PBS沖洗2×3min。
（7)0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。
（8)2×SSC沖洗10min（1×SSC：0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 檸檬酸鈉)。
（9)取10μl含相應(yīng)探針的雜交液滴于標(biāo)本上，如果是cDNA探針則用前將探針于95℃水浴中保溫10min，馬上放入冰浴中冷卻，然后再用。
（10)蓋上22×22mm的硅化蓋片或合適大小的蠟?zāi)ぃ霚睾?3℃保溫12～16h。
（11)4×SSC洗脫蓋片，并在同一液中37℃漂洗10～30min。
（12)2×SSC（含20μg/mlRNaseA, 適于RNA探針)沖洗30min，37℃。
（13)1×SSC，0.1×SSC,37℃各漂洗10～30min。
（14)0.05mol/l PBS 沖洗4×5min。
（15)3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS配)37℃保溫30min。
（16)Avidin –AKP(堿性磷酸酶)（1：500～1：100，0.4%Triton X-100 PBS配)室溫1～3h。
（17)0.05mol/l PBS沖洗4×5min。
（18)TSM1沖洗2×5min。
（19)TSM2沖洗2×5min。
（20)硝基四氮唑藍(lán)（NBT)0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP)0.2mg/ml混合液顯色，室溫，暗處3h。
（21)20mmol/l EDTA,pH8.0終止顯色。
（22)甘油明膠直接封片。
結(jié)果：雜交陽(yáng)性部位著藍(lán)黑色。
組織處理及預(yù)雜交所用器皿需高溫消毒，實(shí)驗(yàn)者需戴手套。
（三)酶促生物素標(biāo)記cRNA探針的應(yīng)用
基本方法和放射性標(biāo)記cRNA探針同，所不同的是探針濃度為2.5μg/μl。顯示探針反應(yīng)步驟如下。
（1)用PBS沖洗粘附有切片的載片2×3min。根據(jù)情況也可用漂洗法。
（2)將載片浸入0.3%H2O2在PBS或甲醇內(nèi)30min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶。
（3)PBS沖洗2×3min，用吸水紙拭干切片周圍的水份，加入小鼠抗生物素血清1：100和PBS含正常羊血清（1：30)，室溫1h，或4℃過夜。
（4)PBS徹底沖洗。
（5)載片加生物素化抗小鼠IgG（1：100)30min室溫。
（6)PBS徹底沖洗。
（7)應(yīng)用ABC復(fù)合物與等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h，室溫。
（8)PBS徹底沖洗。
（9)將切片覆以新鮮配制的0.025%DAB溶液，0.02%H2O2,孵育3～15min。
（10)水洗，復(fù)染，脫水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用銀染，多層ABC或PAP法加強(qiáng)染色效果。
（一)基本原理
地高辛（Digoxigenin 簡(jiǎn)寫Digo-)又稱異羥基洋地黃毒甙配基，這種類固醇半抗原僅限于洋地黃類植物，其抗體與其它任何固醇類似物如人體中的性激素等無交叉反應(yīng)，地高辛配基標(biāo)記于脫氧尿嘧啶三磷酸核苷（dUTP)上形成digoxigenin –11-dUTP（圖20-3)。通過隨機(jī)引物或缺口翻譯法（多用隨機(jī)引物法)，將dig-11-dUTP與探針的核酸分子相連，構(gòu)成Dig-配基標(biāo)記的核酸探針。將這種標(biāo)記的探針與組織、細(xì)胞或染色體原位核酸分子之間的同源序列在一定條件下互補(bǔ)雜交，然后用偶聯(lián)有酶或熒光素的羊抗高地辛抗體Tab（抗原結(jié)合片段)結(jié)合物作為酶標(biāo)或熒光標(biāo)記，再分別用顯色底物使雜交部位顯色或產(chǎn)生熒光以達(dá)到檢測(cè)目的，其反應(yīng)過程見圖20-3。
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圖20-3 地高辛標(biāo)記的探針檢測(cè)酶聯(lián)免疫反應(yīng)
常用的免疫酶學(xué)檢測(cè)方法有兩類：一是Dig –HRP（辣根過氧化物酶)檢測(cè)體系，以DAB（四氫氯化二氨基聯(lián)苯胺)/H2O2為底物，結(jié)果為棕色；或以4-氯-1-萘酚/H2O2為底物，結(jié)果為藍(lán)色。另一是Dig –AKP檢測(cè)體系：以BCIP/NBT為底物，結(jié)果為藍(lán)紫色沉淀。與免疫細(xì)胞化學(xué)方法相似，如應(yīng)用酶促反應(yīng)會(huì)較單一信號(hào)的標(biāo)記物如熒光素具有更高的靈敏度。同樣是酶促化學(xué)反應(yīng)，AKP靈敏度和分辨率較HRP高約10倍左右，但HRP的優(yōu)點(diǎn)為價(jià)廉、穩(wěn)定。
應(yīng)用地高辛標(biāo)記的核酸探針也較穩(wěn)定，據(jù)報(bào)告在-20℃貯存可達(dá)2年，隨時(shí)要取用，不像放射性標(biāo)記探針有半衰期所致的時(shí)間限制。但在現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中，仍喜歡采用新鮮的地高辛配基標(biāo)記3～6個(gè)月以內(nèi)的核酸探針。為節(jié) 省核酸探針的用量，凡使用過的含有探針的雜交液也可反復(fù)多次使用，特別是對(duì)于已知的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。對(duì)于細(xì)胞或組織內(nèi)未知mRNA的檢測(cè)，仍宜采用未使用過的探針雜交液為佳。
與放射性標(biāo)記相比，地高辛標(biāo)記探針具有非放射性探針的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)人體無害，不受半衰期限制，探針可長(zhǎng)期保存。與生物素標(biāo)記探針相比，地高辛探針不受組織、細(xì)胞中內(nèi)源性生物素的干擾，敏感性高。由于地高辛具有靈敏度及分辨率高，反應(yīng)產(chǎn)物顏色鮮艷，jfsoft.net.cn/shouyi/反差好，背景染色低，制備探針可較長(zhǎng)期保存，對(duì)人體無害等優(yōu)點(diǎn)，已日益顯示出它的優(yōu)越性和廣泛的應(yīng)用前景。它不僅可應(yīng)用于原位雜交細(xì)胞化學(xué)，還可應(yīng)用于Southern印跡雜交法檢測(cè)特定基因組序列，進(jìn)行RFLP分析用于基因診斷，菌落原位雜交，噬菌斑原位雜交，固定細(xì)胞及中期染色體原位雜交以及生物體液中，組織中病毒DNA序列的檢測(cè)。這一技術(shù)還被應(yīng)用于檢測(cè)DNA標(biāo)記物及測(cè)序，對(duì)人類染色體連鎖圖譜進(jìn)行構(gòu)建和基因圖譜分析。
（二)基本操作步驟
組織處理及預(yù)雜交等步驟與本章 中敘述的放射性同位素標(biāo)記cRNA探針相同，但由于地高辛標(biāo)記cRNA探針在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中已愈來愈得到廣泛的應(yīng)用，我們?cè)诨痉椒ㄖ腥暂^詳細(xì)的敘述其操作過程。
1．組織前處理在組織制片中以冷凍切片（厚10～30μm)最佳。切片貼在預(yù)先清潔，高溫處理并涂以粘附劑載玻片上，先在37℃預(yù)干燥4h，然后置于37℃烤箱中過夜。經(jīng)過上述處理的切片如在-20℃可保存2～3周，在-70℃可保存數(shù)月之久，有報(bào)告可保存數(shù)年之久的。但仍以新鮮制片為好。如為石蠟包埋切片，應(yīng)脫蠟經(jīng)梯度酒精入水。一般不提倡浸入二甲苯溶液。但在細(xì)胞內(nèi)mRNA含量高時(shí)應(yīng)用二甲苯脫蠟后仍能顯示。經(jīng)水洗后入37℃烤箱4h或過夜，然后進(jìn)行雜交前處理。
在烘烤及低溫保存時(shí)，為防塵埃及空氣中RNA酶的污染，宜用錫箔紙（foilpaper)包被，內(nèi)加少許干燥劑（變色硅膠)。
下列步驟所需玻璃器皿均需消毒，操作者需戴手套。
（1)PBS洗2×3min。
（2)選擇少數(shù)幾張切片作為“RNA酶對(duì)照片”。
其它切片暫放于PBs 內(nèi)。
RNA酶對(duì)照片處理方法：加RNA酶（100μg/ml)在預(yù)熱37℃的溶液內(nèi)。放在潮濕的盛有少許2×SSC塑料盒或蒸發(fā)皿內(nèi)。在每張切片上覆以過量的RNA酶溶液，在37℃孵育30min后用2×SSC沖洗，2×3min，然后與其它保存在PBS的切片一起進(jìn)行下列處理。
（3)蛋白酶K消化：將組織切片放在0.1mol/l Tris/50mmo/L EDTA pH8.0，內(nèi)含蛋白酶K1μg/ml，孵育15～20min。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)組織的種類，厚度反復(fù)試驗(yàn)調(diào)整。時(shí)間過短探針不易進(jìn)入，過長(zhǎng)影響細(xì)胞或組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
（4)0.1mol/L甘氨酸/PBs 5min終止蛋白激酶K反應(yīng)。0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制)10min。
（5)在4%多聚甲醛/PBS3min。
（6)以PBs 漂洗2×3min。
（7)浸入新鮮配制的0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配制)10min，以封閉非特異性結(jié)合部位。
（8)2×SSC漂洗15min。
2．雜交以含cRNA探針（0.5ng/ml)的雜交液，按每張切片10～2μl的量覆蓋切片。地高辛配基標(biāo)記的cRNA核酸探針保存濃度為2.5ng/ml，用前稀釋備用。覆以硅化蓋玻片或塑料蠟?zāi)�，置于盛有少�?×SSC溫盒內(nèi)在42℃，16～18h或過夜。
3．顯示
（1)用緩沖液1沖洗雜交后的載片2×3min。
（2)在緩沖液1中10min，室溫以封閉非特異性結(jié)合部位。
（3)拭干切片周圍的載片，注意保持切片濕潤(rùn)。加數(shù)滴抗地高辛抗血清（工作濃度1：500，以緩沖液1稀釋)，孵育2h，室溫。
（4)緩沖液1漂洗3×3min。
（5)浸入緩沖液210min室溫。
（6)浸入底物中孵育10～30min（或更長(zhǎng)時(shí)間，視需要而定)，底物內(nèi)含顯色BCIP/NBT，室溫。最好用錫箔紙包裹反應(yīng)盒，使顯色在黑暗中進(jìn)行。定期取出切片在顯微鏡下檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度。根據(jù)反應(yīng)強(qiáng)度決定延長(zhǎng)或終止反應(yīng)。反應(yīng)顏色為紫藍(lán)色。
（7)將切片浸入緩沖液3以終止反應(yīng)。
（8)復(fù)染，可用1%伊紅、1%蘇木精、1%亮綠或5%的焦寧（又稱派咯寧丫)（pyronin 丫)10～30s。
（9)流水洗5～10min，直至水無色為止。
（10)在切片未干前，以PBS/甘油封固切片，如要永久保存，可以用DPX在蓋片四周封固。為去除水份，在封固前可進(jìn)行梯度酒精脫水，透明，DPX封固，但每步時(shí)間僅需幾秒鐘，時(shí)間過長(zhǎng)易致褪色。
幾點(diǎn)說明
①緩沖液1，2，3配制法見附錄。緩沖液1中BSA用量大，價(jià)貴，如無法負(fù)擔(dān)可略去。
②切片處理過程可采取漂浮法或載片染色法，載片染色適用于切片數(shù)數(shù)量較少時(shí)，可用液體覆蓋于切片表面進(jìn)行孵育，漂洗在燒杯內(nèi)進(jìn)行。如切片多，可將載片置于方形的染色缸（staining jar)內(nèi)，將沖洗液加入缸內(nèi)，如有振蕩器在漂洗中稍加震蕩更有助于減低背景染色。漂浮法適用于切片數(shù)量大量，將切片置于凹形碟內(nèi)，或染色缸內(nèi)。漂浮法的優(yōu)點(diǎn)是節(jié) 約試劑用量，切片兩面均可接觸反應(yīng)液，有利于信號(hào)的增強(qiáng)。
③在底物中孵育時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生弱強(qiáng)的非特異性染色，有時(shí)甚至誤為陽(yáng)性反應(yīng)。解決方法一是設(shè)置對(duì)照片，二是對(duì)非特異性染色加以區(qū)別。非特異性染色與特異性染色的主要區(qū)別點(diǎn)在于后者有結(jié)構(gòu)性定位，而前者系無結(jié)構(gòu)性定位，常在切片邊緣或細(xì)胞密集處呈現(xiàn)較強(qiáng)的顏色反應(yīng)。
④在組織前處理中應(yīng)嚴(yán)格注意控制RNA酶的污染，包括戴手套、器皿消毒等。另外，和免疫細(xì)胞化學(xué)一樣，自始至終應(yīng)保持切片的濕潤(rùn)，勿令其干燥。
