葡萄球菌蛋白A（Staphylococal Protein A, SPA)是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)。早在1940年，Vevwey發(fā)現(xiàn)在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種物質(zhì)，在雙向擴(kuò)散試驗(yàn)中能與正常人血清形成沉淀。Jensen（1959)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，并將其命名為A抗原。直到1963年Lofkvist等分離了該抗原，并證明它是一www.med126.com種蛋白質(zhì)。為與A與糖相區(qū)別，Grov（1960)將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡(jiǎn)稱SPA或蛋白A（Protein A)。由于SPA的一些免疫特性，它已引起廣大免疫學(xué)者的興趣，并發(fā)展成為免疫學(xué)上一種極為有用的工具。
（1)SPA存在于大多數(shù)（90%)金黃色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中。并且主要存在于血漿凝固酶陽(yáng)性菌株，而不存在于陰性菌株中。前者是致病的，后者是非致病的，但在體內(nèi)研究中尚未發(fā)現(xiàn)SPA和菌株致病性之間有任何肯定的關(guān)系。不同菌株間的SPA含量有明顯差異，以I株金黃色葡萄球菌含SPA量最高，SPA和細(xì)胞壁的肽聚糖呈共價(jià)結(jié)合�？苟籽趸�青霉素突變株（Methicillin—resistant strain)能產(chǎn)生分泌性SPA，它較之細(xì)胞壁所含的SPA在免疫學(xué)性質(zhì)上相似，但易分離，損失少。
（2)SPA為蛋白質(zhì)成分，僅含少量或不含碳水化合物，其分子量因提取方法不同而異，用脫氧核糖核酸酶消化細(xì)胞壁后超速離心或用加熱油提法，所測(cè)分子量為12000～15000。用沉淀平衡分析和在6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽中凝膠過濾，測(cè)出分子量為42000。SPA為多肽單鏈，內(nèi)含3個(gè)高度相似的Fc段結(jié)合區(qū)，每區(qū)由50個(gè)以上的氨基酸組成，不含色氨酸和半胱氨酸。其羧基末端是賴氨酸，氨基末端結(jié)構(gòu)尚未肯定。SPA粘度高于球蛋白，等電點(diǎn)為pH5.1，其天然結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，在應(yīng)用6mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽變性劑的條件下，尚能保存某些三級(jí)結(jié)構(gòu)，如將此變性劑除去，則能自然矯正而恢復(fù)原有結(jié)構(gòu)。
（3)SPA之所以引起免疫學(xué)家的重視，是因?yàn)樗哂械拿庖邔W(xué)特性。SPA具有和人與許多動(dòng)物如豚鼠、豬、小鼠、猴等IgG結(jié)合的能力。SPA結(jié)合部位是Fc段而不是Fab段，這種結(jié)合不會(huì)影響抗體的活性。SPA具有的結(jié)合力是雙價(jià)的，每個(gè)SPA分子可以同時(shí)結(jié)合兩個(gè)IgG分子，也可一方面同IgG相結(jié)合，一方面與標(biāo)記物如熒光素、過氧化物酶、膠體金和鐵蛋白等相結(jié)合。還有一個(gè)饒有興趣的事實(shí)是，和SPA結(jié)合后的IgG可用4mol/L鳥嘌呤鹽酸鹽等使之解離。SPA對(duì)IgG免疫球蛋白亞型的結(jié)合有選擇性，如SPA與人IgG亞型：IgG1、IgG2、和IgG4有結(jié)合力，唯獨(dú)不結(jié)合IgG3。只結(jié)合IgA2，而不結(jié)合IgA1。SPA和禽類血清IgG不結(jié)合。
（4)SPA具有多種生物學(xué)作用，如引起豚鼠解離體回腸和收縮，在吞噬反應(yīng)中抑制IgG調(diào)理素吞噬和殺菌作用，SPA—Igg 復(fù)合物能固定人的補(bǔ)體和人、狗、豬的新鮮補(bǔ)體，對(duì)人類B細(xì)胞具有促有絲分裂因子的作用等。
自70年代開始，國(guó)外應(yīng)用SPA建立了許多敏感、特異性強(qiáng)、快速和簡(jiǎn)易的實(shí)驗(yàn)方法，并在許多方面的應(yīng)用中積累了實(shí)際應(yīng)用的材料，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用到免疫學(xué)及其相關(guān)科學(xué)如細(xì)胞學(xué)、細(xì)菌學(xué)和病毒學(xué)等。其可能應(yīng)用的范圍可歸納為以下四個(gè)方面：
1．應(yīng)用于免疫球蛋白的制備和分析 SPA是一種比較理想的提純和分析免疫球蛋白的試劑。由于SPA與IgG及其某些亞型的Fc段有較強(qiáng)的結(jié)合力，可利用來提純、分析免疫球蛋白制劑，結(jié)合后的PSA—IgG可再用解離劑如4mol/L尿素、4mol/L，硫氰酸鹽或6mol/L的鳥嘌呤鹽酸鹽使之解離，多用SPA—Sepharose 層析柱分離IgG或其亞型及斷片如Fc、Fab等。
2．應(yīng)用于免疫細(xì)胞化學(xué) 由于SPA具有雙價(jià)結(jié)合力，在免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中可作為橋抗體或標(biāo)記抗體。由于SPA能與多種動(dòng)物的Ijfsoft.net.cngG的Fc段結(jié)合，因此，作為第二抗體或標(biāo)記抗體，SPA的最大優(yōu)點(diǎn)是不受種屬特異性的限制，故在目前各種免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)中已得到廣泛的應(yīng)用。除不受種屬限制這一特點(diǎn)外，SPA法還具有染色時(shí)間短、靈敏性高和背景染色淡等優(yōu)點(diǎn)。據(jù)報(bào)告用國(guó)產(chǎn)酶聯(lián)SPA代替酶標(biāo)記抗體，應(yīng)用間接染色，時(shí)間較PAP法省時(shí)一半。SPA分子量�。�13000～42000)，易于穿透組織，而免疫球蛋白酶標(biāo)記抗體為200000，PAP復(fù)合物為430000，均較SPA分子量大。
3．應(yīng)用于多種細(xì)菌、支原體和病毒等病原體的簡(jiǎn)易快速診斷可應(yīng)用SPA菌體作為載體，結(jié)合特異性抗體成為一種吸附原，作協(xié)同凝集劑，用于某些細(xì)菌和病毒的定群和分型（詳見第二章 第三節(jié) )。
4．可作為一種研究免疫復(fù)合物、膜抗原、膜受體和膜Ig的固相吸附劑 Hallgsen用同位素標(biāo)記SPA測(cè)定血IgG的凝集物，發(fā)現(xiàn)85%全身性紅斑狼瘡和42%類風(fēng)濕病人血清中凝集物增高。SPA用于細(xì)胞膜抗原、表面IgG和Fc受體的研究最大特點(diǎn)是能研究活細(xì)菌。Ghetie（1976)用SPA致敏綿羊紅血球，與經(jīng)IgG處理的細(xì)胞形成玫瑰花環(huán)，來鑒定帶Fc受體的細(xì)胞，反之，如用SPA抑制玫瑰花環(huán)形成，則可定量測(cè)定細(xì)胞表面的IgG。應(yīng)用SPA與膠體金或鐵蛋白相結(jié)合，可在電鏡水平檢查抗原抗體反應(yīng)的定位。特別是蛋白A—膠體金技術(shù)（Protein A—Gold technique, PGA技術(shù))自Pomano和Romano（1977)首次報(bào)告用于標(biāo)記細(xì)胞表面抗原、包括淋巴細(xì)胞、血小板、大鼠腎臟細(xì)胞及感染的病毒細(xì)胞獲得成功以后，已得到愈來愈廣泛的應(yīng)用（詳見第七章 )，是一種較為理想的免疫電鏡技術(shù)。
SPA可為多種示蹤物如熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白等所標(biāo)記，應(yīng)用較廣的為酶標(biāo)記SPA和金標(biāo)記SPA技術(shù)，后者將在第七章 中敘述。標(biāo)記SPA常用的酶為HRP�？蓱�(yīng)用于間接法。SPA在PAP法中可代替橋抗體。
1．SPA—HRP用于間接法的操作步驟
（1)切片經(jīng)脫蠟后用0.5%H2O2—純甲醇液處理5min以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。
（2)用Tris鹽酸緩沖液（0.05mol/l pH7.6)洗2次，每次3min。
（3)以第一抗體血清覆蓋處理切片，37℃，孵育30min，或4℃24～48h。
（4)用Tris-HCl緩沖液洗3次，每次5min。
（5)加SPA—HRP（1：100～1：400)處理30min。
（6)Tris-HCl緩沖液洗3次，每次5min。
（7)DAB—H2O2顯色。
（8)復(fù)染、脫水、透明、封固。反應(yīng)物為棕色。
2．SPA用于PAP法的操作步驟
（1)切片脫蠟至水洗。
（2)80%甲醇（含0.6%H2O2)封閉內(nèi)源酶活性5min。
（3)10%卵白蛋白Tris緩沖液，20min。
（4)第一抗體作用37℃，30min或4℃ ，16～48h。
（5)0.05mol/l pH7.6 Tris-HCl緩沖鹽液洗片5min。
（6)SPA（1μg/ml)5min。
（7)Tris-HCl鹽液洗5min。
（8)PAP復(fù)合物（無種屬限制)，5min。
（9)Tris-HCl鹽液洗切片5min。
（10)DAB（0.6mg/ml)，加0.01%H2O2反應(yīng)5min，然后水洗。
（11)復(fù)染：常用Mayer’s蘇木精液數(shù)秒至1min（視需要而定)，水洗。
（12)脫水、透明、封固、鏡檢。
3．SPA—HRP的制備 應(yīng)用Nakane和Kawaoi1974年建立的過碘酸法，酶：SPA=2：1，即HRP10mg,SPA5mg。
（1)10mg 溶于新鮮配制的pH8.1、0.3mol/L碳酸氫鈉溶液1ml，加入0.1ml 1%二硝基氟苯無水乙醇溶液以封閉酶分子中的氨基，使不發(fā)生酶的自身聚合，室溫輕輕攪拌1h。
（2)加入1ml0.04～0.08mol/L（依不同批號(hào)的酶而定)的NaIO4，室溫?cái)嚢?0min。
（3)加入1ml0.16mol/L乙二醇，室溫輕攪1h。
（4)對(duì)1000ml 0.01mol/L pH95 碳酸鹽緩沖液充分透析（4℃，過夜)，換緩沖液3次。
（5)加入5mg SPA的0.1mol/l pH7.4碳酸鈉緩沖液1ml，室溫輕攪2～3h。
（6)加5mg硼氫化鈉（NaBH4)終止氧化，置4℃冰箱3h或過夜。
（7)對(duì)PBS透析24h，4℃離心去沉淀，半飽和硫酸銨洗沉淀結(jié)合物3次，溶于1ml 0.02mol/L pH7.4的PBS中。
（8)對(duì)PBS充分透析，經(jīng)測(cè)定后分裝，貯于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
用過碘酸鈉法可以得到很高標(biāo)記率的HRP-SPA標(biāo)記物，而且保存了抗體的全部活性，敏感度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，大大優(yōu)于戊二醛標(biāo)記抗體法，國(guó)內(nèi)現(xiàn)在也有HRP-SPA的標(biāo)記物供應(yīng)，但要注意由于各家所用的SPA可能來源于不同菌株，在性質(zhì)上可能存在一些差異。
【注意事項(xiàng)】
①在使用二硝基氟苯后，會(huì)產(chǎn)生氟化氫，應(yīng)充分透析除凈，否則抑制酶活性。
②標(biāo)記時(shí)過碘酸濃度不宜過高，氧化時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則會(huì)產(chǎn)生過度標(biāo)記，即多個(gè)酶分子結(jié)合到一個(gè)蛋白A分子上。這些過度標(biāo)記蛋白A的免疫反應(yīng)性很差，容易產(chǎn)生非特異性染色。
③標(biāo)記時(shí)加入酶與SPA的比例應(yīng)適合，比值過大易產(chǎn)生過度標(biāo)記，比值小則標(biāo)記蛋白A產(chǎn)率低。
④過碘酸氧化結(jié)果能使酶具有多個(gè)醛基，從而能與多個(gè)蛋白分子的氨基相結(jié)合，成為一些大分子的聚合物。因此，有作者強(qiáng)調(diào)指出，對(duì)要求具有較強(qiáng)的細(xì)胞穿透力的免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)予以考慮是否適用。但國(guó)內(nèi)有實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用上海生物制品所產(chǎn)生的應(yīng)用過碘酸氧化法制備的HRP—SPA于免疫電鏡研究仍獲得了較為滿意的結(jié)果。
