實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第三節(jié)　凝集素

凝集素（Lectin)是指一種從各種植物，無(wú)脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì))，故名凝集素。其常見種類見表6-1。常用的為植物

表6—1 常見的凝集素一覽表

凝集素（Phytoagglutin, PNA)，通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina,ConA)、麥胚素（Wheat germ agglutinin, WGA)、花生凝集素（Peanutagglutinin, PNA)和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA)等，凝集素是它們的總稱。凝集素不是來(lái)源或參與免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，它們之所以被收入本書，是由于凝集素具有的某些“親合”特性，能被免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)方法所應(yīng)用。因此，Ponder（1983)提出應(yīng)稱“凝集素組織化學(xué)”而不能稱為“凝集素免疫組織化學(xué)”。

一、凝集素的特性

凝集素具有多方面的特性，在此我們僅簡(jiǎn)要提及其與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)方法應(yīng)用有關(guān)的某些特性。我們知道，生物膜中含有一定量的糖類，主要以糖蛋白和糖脂的形式存在。凝集素最大的特點(diǎn)在于它們能識(shí)別糖蛋白和糖肽中，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的碳脂化合物決定簇。一種凝集素具有對(duì)某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力，如刀豆素與α—D—吡喃糖基甘露糖（α—D—Mannopyranosy)結(jié)合；麥芽素與N—乙酰糖胺（N—acetyl glucosamine)結(jié)合；菜豆凝集素與N—乙酰乳糖胺結(jié)合（見本章　表6—1)。 因此，凝集素可以作為一種探針來(lái)研究細(xì)胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡與/或電鏡水平顯示其結(jié)合部位。

二、凝集素的應(yīng)用

一般認(rèn)為細(xì)胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細(xì)胞的類型和反映細(xì)胞在分化、成熟和腫瘤細(xì)胞性變中的變化。僅在某些特殊的例子，其細(xì)胞結(jié)合凝集素的性能可以預(yù)先估計(jì)，如雙花扁豆素之于血型A物質(zhì)的特異性，荊豆凝集素之于血型O物質(zhì)2—L—巖藻糖的特異性，然而在絕大多數(shù)情況下，關(guān)于由凝集素所識(shí)別的碳水化合物決定簇的種類，關(guān)于攜帶決定簇的分子的性質(zhì)和機(jī)能，完全憑實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)去發(fā)現(xiàn)。

1．作為細(xì)胞分化和成熟的標(biāo)記 　應(yīng)用凝集素作為細(xì)胞分化的標(biāo)志，在這方面的應(yīng)用報(bào)告最多，而且研究比較集中于血細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞的分群。如Rose（1980)等發(fā)現(xiàn)在小鼠胸腺皮質(zhì)內(nèi)不成熟的T淋巴細(xì)胞呈PNA陽(yáng)性反應(yīng)，在小鼠小腸集合淋巴小結(jié)的生發(fā)中心也發(fā)現(xiàn)有20%左右的PNA陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞，后者是否屬于不成熟的T淋巴細(xì)胞，是值得進(jìn)一步研究的問題。Newman等（1979)以熒光素標(biāo)記凝集素PNA，發(fā)現(xiàn)在大鼠乳腺上皮的不同分化時(shí)期顯示不同的熒光強(qiáng)度。在不成熟的大鼠乳腺上皮細(xì)胞，熒光弱或無(wú)，隨著性成熟期到妊娠期乳腺上皮熒光程度逐漸加強(qiáng)，而泌乳期熒光強(qiáng)度達(dá)最高峰。在皮膚角質(zhì)細(xì)胞自基底向表層分化、成熟的過程中，細(xì)胞表面的碳水化合物的分布和性質(zhì)都在改變。Brabed等（1981)應(yīng)用新生大鼠皮膚的實(shí)驗(yàn)表明，皮膚各層細(xì)胞分別與不同的凝集素相結(jié)合。麥芽素與角質(zhì)化細(xì)胞相結(jié)合，蓖麻素與棘細(xì)胞和基底細(xì)胞相結(jié)合，而荊豆凝集素標(biāo)記在棘細(xì)胞的表面。在成肌細(xì)胞（myeoblast)的分化與成熟過程中，Winaod 和Luzzati（1975)注意到類似的皮膚的改變。

2．作為細(xì)胞特殊類型的標(biāo)記　Kivela和Farkkanen（1987)發(fā)現(xiàn)在人視網(wǎng)膜，PNA標(biāo)記視錐細(xì)胞而不標(biāo)記視桿細(xì)胞。在乳腺、乳腺上皮細(xì)胞呈PNA陽(yáng)性反應(yīng)而肌上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞呈PNA陰性反應(yīng)。以多種凝集素對(duì)小鼠、大鼠和兔的腎組織切片進(jìn)行染色結(jié)果表明，刀豆素A和蓖麻素存在于腎臟的各部，PNA和雙花扁豆凝集素（DBA)主要分布于遠(yuǎn)曲小管和集合小管上皮細(xì)胞，荊豆凝集素（UEA)主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，而麥芽素分布在腎小球。應(yīng)用DBA對(duì)RIII和DDK品種的小鼠研究表明，DBA主要結(jié)合在各種組織內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，電鏡觀察顯示DBA結(jié)合在內(nèi)皮細(xì)胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些組織的內(nèi)皮細(xì)胞顯示肯定的DBA陰性反應(yīng)，說明同一種屬動(dòng)物的血管內(nèi)皮細(xì)胞也存在有組織特異性的差別。Streit和Kreutzberg（1987)發(fā)現(xiàn)GriffoniaSimplicifolia凝集素特異性標(biāo)記面神經(jīng)節(jié)　內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞，其它類型的膠質(zhì)細(xì)胞如星狀膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte)等都顯示陰性反應(yīng)。在切斷面神經(jīng)后，增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Griffonia Simplicifolia凝集素的反應(yīng)加強(qiáng)，免疫電鏡觀察表明，凝集素主要沉積在細(xì)胞膜或小膠質(zhì)細(xì)胞突起的軸膜表面，特異性結(jié)合糖基是α—D—半乳糖。上海醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院免疫病理jfsoft.net.cn/hushi/室應(yīng)用12種凝集素（表6-1)對(duì)人胚胎及各種正常組織進(jìn)行了系統(tǒng)的凝集素受體的定位研究，結(jié)果表明，凝集素受體的分布并無(wú)即定規(guī)律可尋。如胃粘膜主細(xì)胞為PNA受體，而壁細(xì)胞為BSL受體，雙花扁豆受體（DBA)主要出現(xiàn)在大腸部份。

3．在腫瘤中凝集素結(jié)合的改變 　腫瘤細(xì)胞伴有細(xì)胞膜的改變，細(xì)胞膜上的糖基也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，可用凝集素檢測(cè)出來(lái)。大量研究發(fā)現(xiàn)，凝集素可作為腫瘤組織源性的標(biāo)記、腫瘤特異性診斷的標(biāo)志、腫瘤惡性的標(biāo)記和不同腫瘤的分化標(biāo)記。如張華忠等（1987)報(bào)道115例胃癌標(biāo)記PHA陽(yáng)性率高達(dá)90.43%，而正常胃粘膜基本是陰性，故認(rèn)為PHA是胃癌的診斷性標(biāo)志。BSA對(duì)乳腺惡性腫瘤陽(yáng)性率達(dá)79%，而對(duì)良性病變均呈陰性反應(yīng)，提示BSA可能為乳腺惡性腫瘤的相關(guān)標(biāo)志。凝集素還有助于判別腫瘤的組織類型，如神經(jīng)系統(tǒng)星形細(xì)胞瘤ConA陽(yáng)性，小膠質(zhì)細(xì)胞瘤陰性，腎腺癌UEA1陰性，透明細(xì)胞癌陽(yáng)性。

三、凝集素在免疫細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用

凝集素可為熒光素、酶和生物素等所標(biāo)記，分別進(jìn)行下列染色法：

1．直接法　 標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合。

（1)切片脫蠟至水。

（2)凝集素標(biāo)記物（100μg/ml)，室溫，30min。

（3)TBS洗3次，每次2min。

（4)如為熒光素標(biāo)記物，封片用熒光顯微鏡觀察。如為酶標(biāo)記物，則應(yīng)依次進(jìn)行呈色、脫水、透明和封固后在光學(xué)顯微下觀察。

直接法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，目前商品用的凝集素藥盒已能購(gòu)得。但靈敏性不夠高。

2．間接法 　將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，而將標(biāo)記物結(jié)合在抗凝集素抗體上。

（1)脫蠟至水。

（2)用含3%的H2O2的甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min。

（3)凝集素稀釋液（100μg/ml)孵育30min。

（4)TBS洗3次，每次2min。

（5)用標(biāo)記了的抗凝集素抗體（1：100)孵育30min。

（6)TBS洗3次，每次2min。

（7)呈色、脫水、透明、封片。

（8)觀察。

間接法染色還可進(jìn)一步改良為：①三步法：即在凝集素孵育后，接著用抗凝集素抗體孵育，再用標(biāo)記了的抗-抗凝集素抗體孵育，層層放大，進(jìn)一步提高其敏感性，PAP復(fù)合物也可作為標(biāo)記物標(biāo)記在抗-抗凝集素抗體上。②抗生物素—生物素凝集素法：用結(jié)合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—標(biāo)記物與之結(jié)合。間接法較直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必須購(gòu)買或自制抗凝集素抗體。

3．糖—凝集素—糖法　本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合。經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部位，將這些部位與有過氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個(gè)三明治樣的糖—凝集素—糖的結(jié)合物。

（1)脫蠟至水。

（2)用含3%的H2O2的甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min。

（3)用100μg/ml的凝集素孵育30min。

（4)TBS洗3次，每次3min。

（5)用100μg/mlHRP標(biāo)記的糖液孵育30min。

（6)TBS洗3次，每次3min。

（7)DAB呈色、脫水、透明、封固。

本法特異性強(qiáng)，靈敏度高，因?yàn)檫@不象生物素—抗生物素法那樣要改變凝集素，又不需要像抗體那樣要制備抗體。HRP本身含有甘露糖，能與刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素結(jié)合。但對(duì)其它的凝集素，本法目前普及還有一定困難，因?yàn)橐獙⑦^氧化物酶結(jié)合到其它凝集素上，就需要將一個(gè)適當(dāng)?shù)奶妓�化合物基團(tuán)嵌入過氧化物酶，稱為糖基化（glycosylation)，方法雖不復(fù)雜（Lee 等1976)，但需一定的試劑和設(shè)備。商品化能提供的糖基化過氧化物酶品種尚有限。

【注意事項(xiàng)】

①凝集素需要重金屬離子維持其活躍的結(jié)合部位，如果金屬離子耗盡了，就會(huì)影響凝集素的結(jié)合能力。因此，有作者主張用TBS作為緩沖液，內(nèi)加微量的金屬，配方是：Tris 60.57g,NaCl87g,H2O加至1000ml，其中含CaCl2、MgCl2各1.0mmol/L�；蛟谶M(jìn)入凝集素孵育前，先用該液孵育，以增強(qiáng)凝集素結(jié)合力。

②和其它抗體血清應(yīng)用一樣， 應(yīng)用每批新的凝集素實(shí)驗(yàn)時(shí)，都先要用緩沖液稀釋成不同等級(jí)；如8，16，32，64，125，250，500，1000μg/ml，經(jīng)染色選擇最佳稀釋度。

③有作者認(rèn)為阻斷組織內(nèi)源性過氧化物酶所用的H2O2對(duì)碳水化合物有影響，可能改變凝集素的結(jié)合形式，因此，應(yīng)盡量少用或不用，我們及一些作者在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)影響不明顯。

④有作者認(rèn)為凡經(jīng)固定的組織切片，不論是石蠟包埋切片或冰凍切片，都有可能使組織中抗原隱蔽，為了暴露隱蔽了的碳水化合物基團(tuán)，主張?jiān)谀�集素孵育前用酶處理切片，常用胰蛋白酶液（配制見附�?進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆跤��?/p>

⑤已知哺乳動(dòng)物的質(zhì)膜含有占蛋白總量的1%～10%的碳水化合物，它們以低聚糖（oligosacchride)糖脂，并主要以糖蛋白的形式存在，糖蛋白線性的或分支的旁鏈可能含有兩個(gè)到多個(gè)單糖殘基，通常有兩種或更多的單糖，在單糖單位末端常常是一個(gè)帶負(fù)電荷的N-乙酰神經(jīng)氨酸的殘基，一個(gè)唾液酸（siallic acid)。有作者在凝集素實(shí)驗(yàn)中常用神經(jīng)氨酸酶(neuramidinase)分解細(xì)胞表面的唾液酸或神經(jīng)氨酸，以暴露出隱蔽的能與聚集素結(jié)合的次終末的碳水化合物。配制方法是將神經(jīng)氨酸酶（Type V,Sigma Lot 63F—8172 63F--8172)用醋酸緩沖液（含2%牛血清白蛋白)BSA配成0.5μg/ml。

切片脫蠟后進(jìn)行酶消化的過程中，將該組織切片置于上述配制液中，在濕盒內(nèi)，37℃孵育30min。用緩沖液洗后，進(jìn)行凝集素染色。

⑥對(duì)照試驗(yàn)，和其它組化染色一樣，凝集素染色也需要設(shè)對(duì)照試驗(yàn)（最好在相鄰切片進(jìn)行)。由于凝集素具有單糖特異性，如果外加相應(yīng)的糖，把凝集素的結(jié)合部位占有了，凝集素就不能再與組織中的糖基相結(jié)合了。一般采用的方法是將凝集素預(yù)先與相應(yīng)的糖（0.2mol/L)在室溫孵育30min，使之占有凝集素結(jié)合部位，再將此液代替凝集素進(jìn)行孵育，結(jié)果應(yīng)為陰性。在某些情況下即使提高糖液的濃度也不能達(dá)到完全的抑制。這時(shí)，只有用與凝集素有高親合力的低聚糖（oligosachrides)代替或?qū)⑶衅�預(yù)先用相應(yīng)的糖苷酶孵育去除特異性糖基（Watanalte等，1981)。

四、HRP標(biāo)記凝集素及凝集素抗體的制備

1．HRP標(biāo)記凝集素法 適用于小量的凝集素標(biāo)記（Ponder 1983)。

（1)HRP的活化

①將10mg HRP(SigmaType VI)溶解在1ml 0.3mol/L 的重碳酸鈉溶液中（1.25g/50ml)。

②加50μl含1%氟二硝基苯的無(wú)水乙醇溶液，室溫輕度攪拌1h。

③加1ml含0.06mol/L的過碘酸鈉的蒸餾水（0.62g/50ml)，室溫下輕度攪拌30min。

④在室溫下加兩滴0.16mol/L乙二醇，輕攪1h。

⑤用Sephadex G—25裝成小柱，用0.3mol/L的重碳酸鈉溶液，使含HRP的混合液過柱。

（2)結(jié)合

①正常條件下，可用凝集素及過氧化物酶各半量，但其比例可根據(jù)需要調(diào)整，以10mg凝集素溶解在25ml的重碳酸鹽緩沖液里，加到“活化”的HRP中去 ，這樣得出的凝集素濃度大約是0.3mg/ml，可加進(jìn)0.1mol/L相應(yīng)的特異的糖，以保護(hù)凝集素結(jié)合時(shí)的結(jié)合部位。糖在下步透析或?qū)游鰰r(shí)去掉。

②在室溫下輕攪拌，結(jié)合3h。

③加入1mg硼氫化鈉，室溫下作用1h以穩(wěn)定結(jié)合物活性。

④用1N HCl調(diào)整pH至6.4，留置室溫下過夜。

（3)純化

①用適當(dāng)?shù)哪�膠層析柱如SephadexG—200、Saphacryl—300層析法將游離的凝集素、游離的過氧化物酶和高分子量的成分從結(jié)合物分離出去，包括抑制性的糖也在此時(shí)分離出去。

②提純后的結(jié)合物在280nm和403nm波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光率。用1%BSA先通過0.22μm的微孔過濾器，以確定被結(jié)合的凝集素是否被吸附在濾器中，然后上述結(jié)合物經(jīng)過該微孔濾過器過濾到一個(gè)無(wú)菌瓶中。

③加入疊氮鈉，濃度1：1000，保存于4℃C備用。

2．抗凝集素抗體的制備 　抗凝集素抗體的制備法與一般免疫血清制備大致相同（見第二章　)。所不同的是：①凝集素具有較強(qiáng)的毒性，易使被免疫動(dòng)物發(fā)病或甚至死亡。解決的方法是經(jīng)處理使凝集素變性，從而減低其毒性，但同時(shí)要保證其抗原性不受或少受破壞。②要設(shè)法阻斷凝集素的糖結(jié)合部位，以減少對(duì)這些部位的抗體的產(chǎn)生，解決的辦法是預(yù)先以相應(yīng)的糖阻斷這些結(jié)合部位。Leathem 和Atkin（1982)設(shè)計(jì)了一個(gè)辦法，他們首先應(yīng)用瓊脂糖（Sepharose)珠，珠上有一系列共價(jià)糖的附著，這些糖可阻斷凝集素結(jié)合部位，這種糖珠有商品供應(yīng)（Sigma LtD)，每1ml糖珠能結(jié)合大約12mg凝集素。其次用加入福爾馬林和加熱的方法使凝集素變性，毒性減低而不影響抗原性。具體操作如下：

①1ml瓊脂糖—半乳糖珠與1mg花生凝集素相結(jié)合，室溫1h。

②加入10ml 10%福爾馬林，在水浴中加熱到60℃，1h。

③用鹽水離心洗珠，將珠分成以10μl為單位的若干小份，保存在-20℃。

④皮下多處注射兩只家兔背部，每次注射100μl，每隔三周注射一次。取血40～50ml，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>