實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第四節(jié)　免疫活性細(xì)胞及其腫瘤的免疫細(xì)胞學(xué)

免疫活性細(xì)胞組成人體免疫系統(tǒng)組織、器官，是維持人體內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定，消除體內(nèi)外抗原性物質(zhì)之危害，起著免疫監(jiān)視作用，是當(dāng)代重視和研究地十分深入的領(lǐng)域。免疫活性細(xì)胞主要包括淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞及網(wǎng)狀細(xì)胞等。它們產(chǎn)生的腫瘤—惡性淋巴瘤，是預(yù)后差的一類腫瘤，其形態(tài)與分型十分復(fù)雜。由于淋巴網(wǎng)狀組織學(xué)及功能的特殊性等因各種抗原性刺激而引起的淋巴網(wǎng)狀組織反應(yīng)性增生（Reactive Hyperplasia, RH)、改變復(fù)雜，其與惡性淋巴瘤在組織學(xué)方面鑒別很困難，誤診率可達(dá)10%～30%，是臨床病理診斷中的難題。由于免疫細(xì)胞化學(xué)，分子生物學(xué)的發(fā)展，已有可能利用單克隆抗體（McAb)或多克隆抗體（PcAb)和IgH,TCR（T細(xì)胞受體)基因重排檢測(cè)技術(shù)，將免疫活性細(xì)胞及其腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞系及分化期、亞型、淋巴瘤良、惡性進(jìn)行鑒別診斷。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)簡(jiǎn)單易行，具有一定的特異性。且可在組織原位標(biāo)記。并可用于印片或細(xì)胞懸液，配合流式細(xì)胞儀，提供更為精細(xì)的信息。目前市場(chǎng)供應(yīng)的McAb 與PcAb可已有百種。國(guó)際統(tǒng)一稱之為CD系列。已往還有OKT系列和Leu系列。但仍有不足的一面，所有抗體在特異性，表達(dá)率均有不足。而且在良、惡性的鑒別作用更是有限。

一、免疫活性細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)

（一)B淋巴細(xì)胞

B淋巴細(xì)胞從骨髓干細(xì)胞到分化成熟稱為非抗原依賴期。成熟B小淋巴細(xì)胞受到抗原刺激后可產(chǎn)生增殖衍化，演變成漿細(xì)胞合成分泌Ig。B淋巴細(xì)胞存在細(xì)胞表面Ig(SIg)及細(xì)胞內(nèi)Ig(CIg)。人們利用SIg 與CIg作為抗原制成許多標(biāo)記抗體。SIg標(biāo)記只存在于次成熟的轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞。且多數(shù)為IgM·G，而幼稚的前B淋巴細(xì)胞與漿細(xì)胞缺乏SIg標(biāo)記。目前較常用的SIg標(biāo)記McAb有CD₁₉，CD₂₀，CD₂₂，需冰凍切處新鮮組織，而L₂₆則可用于石蠟切片。后又增加LN—1，LN-2，LN-3，MB-1，MB-2及4KB₅等石蠟切片標(biāo)記抗體。稱它們?yōu)槿獴抗體。

Cig可分Ig重鏈包括IgM、Igg IgA、IgD、IgE5種，輕鏈λ、k兩種，CIg標(biāo)記抗體表達(dá)在愈成熟的B淋巴細(xì)胞，幼稚者則陰性。在不同部位組織其表達(dá)也不一致。如淋巴結(jié)生發(fā)中心B細(xì)胞表達(dá)IgD，而腸粘膜淋巴組織中的生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞則表達(dá)IgA。上述IgH、L抗體在一些因素的影響下，真正表達(dá)率只有75%左右，而且如巨噬組織、R-S細(xì)胞等可以吸收血漿中的Ig而出現(xiàn)假陽(yáng)性。

表12-2 介紹了淋巴細(xì)胞分化各階段的部位、免疫表型和相關(guān)腫瘤，請(qǐng)參閱。

表12-2B淋巴細(xì)胞分化各階段細(xì)胞的部位、免疫表型和相關(guān)腫瘤

（二)T淋巴細(xì)胞

由于T細(xì)胞表面存在羊紅細(xì)胞受體（E-R)，人們利用T細(xì)胞受體作抗原制成多種McAb，如CD₂，T₁₁，OKT₁₁，Leu₅等。發(fā)育不同階段的T細(xì)胞ER數(shù)量及親和力不同。未分化T細(xì)胞與前T細(xì)胞缺乏ER，但它可用TdT抗體標(biāo)記。T淋巴細(xì)胞又分輔助T/誘導(dǎo)（T_H/T₁)志抑制T/毒性T（T_S/T_K)兩大亞型。T_H標(biāo)記抗體有CD₄等，T_S標(biāo)記抗體有CD₈。上述幾種抗體要新鮮組織冰凍切片。一般難于廣泛使用。最近制出UCHL-1，MT-1Leu₂₂(L₆₀)等石蠟切片全T性標(biāo)記抗體，其中UCHL-1已被廣泛采用。新近又推出A₆，MCA₆，比UCHL-1效果要好。OPD₄可用于石蠟切片T_H標(biāo)記。CD₅，CD₆等McAb特異性不足，可以標(biāo)記少數(shù)B淋巴細(xì)胞，粒細(xì)胞等。

表12-3 介紹了T淋巴細(xì)胞分布及各階段細(xì)胞的部位、免疫表型和相關(guān)腫瘤，請(qǐng)參閱。

表12-3 T淋巴細(xì)胞分化各階段細(xì)胞的部位、免疫表型和相關(guān)腫瘤

表12-2、12-3引自全國(guó)第六屆淋巴瘤學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編，惡性淋巴溜和白血病的免疫組織化學(xué)（綜述)上海腫瘤醫(yī)院，朱雄增。

（三)NK細(xì)胞/K細(xì)胞

目前認(rèn)為NK細(xì)胞是一種自然殺傷細(xì)胞，它殺傷特異性細(xì)胞，事先無(wú)需致敏，亦無(wú)MHC限制的淋巴細(xì)胞。K細(xì)胞是指能介導(dǎo)ADCC（抗體依賴性毒性淋巴細(xì)胞)。過(guò)去曾認(rèn)為NK細(xì)胞是胞漿中含有粗大溶酶體的顆粒性大細(xì)胞。現(xiàn)已證明它在分化成熟后才有這一特征。它的表面有高親和力的IL-2受體，在IL-2刺激下可以增殖和表達(dá)細(xì)胞毒性�；钚院蟮腘K細(xì)胞還可表達(dá)HLA-DR抗原。NK細(xì)胞的標(biāo)記特點(diǎn)是CD₅₆，CD₂ER，Igg FcR/C₃R均陽(yáng)性表達(dá)，而CD₃，CD₇，CD₁₉陰性表達(dá)。后發(fā)現(xiàn)CD₅₇，CD₅₆也是較特異性McAb。對(duì)K細(xì)胞與NK細(xì)胞之間的關(guān)系尚有不同意見(jiàn)，但多數(shù)認(rèn)為二者www.med126.com系由同一細(xì)胞介導(dǎo)。

（四)單核/巨噬細(xì)胞與網(wǎng)狀細(xì)胞

單核/巨噬細(xì)胞不僅參與抗原的提呈和免疫調(diào)節(jié)　，而且是具有特異和非特異吞噬異物功能的免疫活性細(xì)胞。單核細(xì)胞起源于骨髓干細(xì)胞，進(jìn)入血流，當(dāng)它到達(dá)組織則稱組織細(xì)胞。在出現(xiàn)吞噬時(shí)則稱巨噬細(xì)胞。它分布于不同組織，如枯否氏細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞，腹腔巨噬細(xì)胞，腦小膠質(zhì)細(xì)胞，甚至破骨細(xì)胞等，這類細(xì)胞統(tǒng)稱為單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。不同組織的巨噬細(xì)胞其生物學(xué)特性亦有差異。應(yīng)用的標(biāo)記抗體有抗溶菌酶（lys)，抗α₁-胰蛋白酶（AAT)，抗α₁-糜蛋白酶（ACT)抗體均可用于石蠟切片標(biāo)記。其中l(wèi)ys抗體反應(yīng)較弱，敏感度不足。新近又推出Mac387,KP1標(biāo)記抗體、效果十分滿意。另外還有CD₁₁₆，CD₆₄，CD₃₂等FCR抗體，需冰凍切片。

網(wǎng)狀細(xì)胞，過(guò)去認(rèn)為它是組織細(xì)胞同類細(xì)胞。但已證明它是固定于淋巴網(wǎng)狀組織的一類無(wú)吞噬功能，但可傳遞抗原信息、調(diào)節(jié)　免疫功能。其細(xì)胞發(fā)生尚有爭(zhēng)議。其中包括生發(fā)中心樹突網(wǎng)狀細(xì)胞（DRC)，指突狀網(wǎng)狀細(xì)胞（IRC)，在髓質(zhì)淋巴竇附近的纖維母細(xì)胞網(wǎng)狀細(xì)胞以及主要分布在皮膚表皮的朗格罕氏細(xì)胞（Langerhan’s cell)等。這類細(xì)胞均有類似巨噬細(xì)胞的HLA-DR抗原表達(dá)，但較弱。它們可對(duì)S—100蛋白陽(yáng)性表達(dá)，是與巨噬細(xì)胞不同之點(diǎn)。

二、惡性淋巴瘤的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記

惡性淋巴瘤總的可分為非何杰金淋巴瘤（NHL)與何杰金氏病兩大部分。NHL的免疫功能分類繁多�？傮w上各類型的瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記與相應(yīng)的正常細(xì)胞標(biāo)記相一致。但是由于瘤細(xì)胞的基因有變異，分化不正常，其抗原性也發(fā)生變化。因此瘤細(xì)胞比相應(yīng)正常細(xì)胞的表達(dá)要弱或喪失。在此不分型描述，而從應(yīng)用角度分為下列三方面進(jìn)行討論：

（一)惡性淋巴瘤與淋巴網(wǎng)狀組織反應(yīng)性增生的鑒別診斷

組織學(xué)鑒別，在早期濾泡內(nèi)型濾泡型淋巴瘤與淋巴濾泡瘤樣增生、高分化的NHL與RH及假陽(yáng)性淋巴瘤鑒別方面存在相當(dāng)?shù)睦щy。必需借于其他有效技術(shù)方法。但免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記有一定限制性。其中B淋巴瘤與RH鑒別中可以應(yīng)用IgH和或Igl 標(biāo)記，及有75%左右的惡性淋巴瘤為IgH和/或IgL單項(xiàng)陽(yáng)性，即為單克隆性增生，相反如為2項(xiàng)以上陽(yáng)性為多克隆性RH，但有時(shí)少數(shù)淋巴瘤可出現(xiàn)雙克隆性，這方面應(yīng)嚴(yán)格排除其他因素引起的假陽(yáng)性和假陰性，故仍需緊密結(jié)合組織學(xué)改變。T淋巴瘤則缺乏單克隆性標(biāo)記抗體，在應(yīng)用全T性抗體標(biāo)記出現(xiàn)單一性或高度優(yōu)勢(shì)標(biāo)記，再結(jié)合組織學(xué)改變可以輔助識(shí)別良、惡性。新近報(bào)告富于T細(xì)胞的B淋巴瘤或富于B細(xì)胞的T淋巴瘤（在瘤細(xì)胞間伴有大量反應(yīng)性成熟T或B淋巴細(xì)胞)，這與良性反應(yīng)性增生更為困難。若瘤細(xì)胞體積增大，出現(xiàn)T或B單一性標(biāo)記，而反應(yīng)性淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)T、B及組織細(xì)胞混雜標(biāo)記，則有助于良惡性炎鑒別，另外可加用PCNA（增殖細(xì)胞核抗原)或Ki—67標(biāo)記，則瘤細(xì)胞一般為陽(yáng)性。

（二)惡性淋巴瘤與非淋巴瘤網(wǎng)狀組織腫瘤的鑒別

目前有較多的報(bào)告淋巴結(jié)外組織未分小細(xì)胞癌或網(wǎng)瘤，常規(guī)切片很難與惡性淋巴瘤區(qū)別，小細(xì)胞肉瘤有胚胎性橫紋肌肉瘤、外周性神經(jīng)母細(xì)胞瘤，Ewing’s肉瘤，Merkel細(xì)胞癌以及無(wú)色素性惡性黑色素瘤。應(yīng)用免疫組化有較好的鑒別作用。首先應(yīng)根據(jù)HE組織學(xué)改變，一般特殊組織化學(xué)染色初步確定某一類腫瘤的可能。再?gòu)目傮w上先作LCA（白細(xì)胞共同抗原)與EMA（上皮膜抗原)免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記。確定是淋巴瘤還是未分瘤。如果兩者均陰性則應(yīng)加作其他淋巴瘤抗體標(biāo)記。因?yàn)長(zhǎng)CA抗體在漿細(xì)胞瘤，T淋巴母細(xì)胞淋巴瘤及何杰金氏病R—R細(xì)胞不表達(dá)。上述標(biāo)記全陰性，則應(yīng)作Vimentin標(biāo)記，如為陽(yáng)性，則為間葉組織源。再用肌球蛋白標(biāo)記陽(yáng)性為胚胎性橫紋肌肉瘤。作糖元染色陽(yáng)性為Ewing肉瘤，NSE陽(yáng)性為Merkel細(xì)胞或肺小細(xì)胞癌，S—100陽(yáng)性為神經(jīng)母細(xì)胞瘤。

（三)惡性淋巴瘤的免疫細(xì)胞分型

淋巴瘤分型對(duì)病人預(yù)后的估計(jì)，臨床治療有指導(dǎo)性意義。但這不如良惡性鑒別重要。在日常外檢中進(jìn)行淋巴瘤分型，應(yīng)挑選針對(duì)性強(qiáng)、特異性高、使用方便的標(biāo)記抗體。如有條件的單位以新鮮組織冰凍切片標(biāo)記、陽(yáng)性率高。一般單位病理科則選用石蠟切片標(biāo)記抗體。目前比較常用而效果穩(wěn)定的石蠟切片標(biāo)記抗體有L₂₆（全B，除漿細(xì)胞瘤)UCL1（全T )KP1或Mac387組織細(xì)胞標(biāo)記。T淋巴瘤應(yīng)用CD₄與CD₈標(biāo)記區(qū)別輔助T或抑制T。

以上為NHL標(biāo)記分型。關(guān)于HD的R-S細(xì)胞標(biāo)記。R—s 細(xì)胞的發(fā)生組織細(xì)胞至今尚未完全肯定、R—S細(xì)胞標(biāo)記抗體最先應(yīng)用LeuM₁(CD₁₅)抗體，它對(duì)HD—LPL—H型R—S細(xì)胞不標(biāo)記。且對(duì)粒細(xì)胞、T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞，甚至上皮細(xì)胞也陽(yáng)性。最近由體外培養(yǎng)的R—S細(xì)胞提取抗原制成的Ki-1McAb、對(duì)所有類型的R—S細(xì)胞均為陽(yáng)性表達(dá)。但對(duì)活化的T或B淋巴細(xì)胞亦陽(yáng)性。且需作冰凍切片染色。而可在石蠟切片表達(dá)的Ber—H₂抗體問(wèn)世，就解決了困難問(wèn)題。

（四)在惡性淋巴瘤免疫表型分析中的注意事項(xiàng)

為了正確應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記手段在惡性淋巴瘤診斷，分型等方面發(fā)揮更大的作用應(yīng)注意下列問(wèn)題：①免疫細(xì)胞化學(xué)在惡性淋巴瘤分析中應(yīng)緊密結(jié)合組織學(xué)改變，有目的地選用高效、廣譜的抗體，淋巴瘤常用標(biāo)記抗體見(jiàn)表12-4。因?yàn)槊庖呒?xì)胞化學(xué)的結(jié)果受到多種因素的影響，可以出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性；②為了避免因抗體標(biāo)記的局限性而造成漏診，有條件的單位最好一次用同功能的幾種抗體，這樣可以起來(lái)抗體間的反應(yīng)互補(bǔ)性，往往比單項(xiàng)抗體jfsoft.net.cn/wszg/的標(biāo)記率高；③標(biāo)本固定要及時(shí)，應(yīng)用中性福爾馬林液或B₅固定液，則抗原保存要好一些。盡可能應(yīng)用低壓，低溫（60^℃以下)浸蠟，減少抗原的破壞丟失；④抗體的濃度要適當(dāng)，消除背景染色。加用二甲砷酸鈉可除去背景著色。特別膜標(biāo)記陽(yáng)性時(shí)與背景著色很難區(qū)分。前者包繞細(xì)胞呈環(huán)狀；⑤每次染色應(yīng)有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；⑥目前淋巴瘤的基因重排檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)建立。特別是多聚酶鏈反應(yīng)（PCR)擴(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用，提供了特異（無(wú)假陽(yáng)性)，敏感（可檢測(cè)出1/100萬(wàn)瘤細(xì)胞)快速（當(dāng)天可出報(bào)告)的淋巴瘤檢測(cè)手段。作者科室已建立了該項(xiàng)技術(shù)。雖然其設(shè)備條件要求比較高�？勺鳛橐呻y、早期、化療后殘留病灶病例的確診。

表12-4 淋巴瘤常用標(biāo)記抗體

※可用石蠟切片標(biāo)記的McAb