野鴨大腸桿菌和沙門(mén)氏菌混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷
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鳥(niǎo)禽類大腸桿菌和沙門(mén)氏桿菌混合感染是當(dāng)前禽病流行中的主要趨勢(shì)，是養(yǎng)禽業(yè)的常見(jiàn)病和多發(fā)病。2種細(xì)菌血清型種類較多，不同地區(qū)差別較大；不同菌株之間不產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，極易產(chǎn)生耐藥性。一旦鳥(niǎo)禽發(fā)病，治療時(shí)間長(zhǎng)、難度大。 某地野生動(dòng)物園的一群美國(guó)綠頭野鴨，在2002年7月中旬突然發(fā)病，表現(xiàn)為腳軟、不能站立、拉稀、精神不振，死亡率高，曾用
青霉素、
四環(huán)素等藥物治療無(wú)效。為了確診，將病死野鴨進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗(yàn)等�，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 主要儀器。高壓滅菌鍋，電子天平，生化培養(yǎng)箱，顯微鏡，恒溫箱，無(wú)菌操作臺(tái)。 1.1.2 被檢材料。病死野鴨的心血、肝等組織。 1.1.3 培養(yǎng)基。普通瓊脂、胰蛋白胨、瓊脂培養(yǎng)基。 1.1.4 藥敏紙片。青霉素、四環(huán)素、
萬(wàn)古霉素、桿菌肽、
妥布霉素、
環(huán)丙沙星、
諾氟沙星、苯唑青霉素、
阿米卡星、
頭孢噻肟、頭胞呋新、卡那霉素、
氧氟沙星、壯觀霉素共14種藥敏紙片。 1.1.5 微量發(fā)酵管。
葡萄糖、
賴氨酸、
鳥(niǎo)氨酸、硫化氫、蛋氨酸、乳糖、衛(wèi)矛醇、苯丙氨酸、
尿素酶、枸椽酸、
氨基酸（對(duì)照級(jí))共11種微量發(fā)酵管。 1.1.6 姬姆薩氏染液。 1.1.7 試驗(yàn)動(dòng)物。8只10～20g昆系小白鼠，由西南農(nóng)業(yè)大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物科提供。 1.2 方法 1.2.1 染色鏡檢。取病死野鴨心血、肝抹片或涂片，按常規(guī)姬姆薩氏染色后鏡檢。 1.2.2 分離培養(yǎng)。無(wú)菌采集病野鴨心血、肝等，分別接種普通肉湯和胰蛋白胨肉湯，37℃培養(yǎng)24h后觀察。若有細(xì)菌生長(zhǎng)，再劃線接種普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h。 1.2.3 純化細(xì)菌。將普通瓊脂平板上的細(xì)菌接種到SS瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，分別挑取單個(gè)菌落接種普通肉湯，37℃培養(yǎng)24h，純化并進(jìn)行編號(hào)，備用（紅色菌落編為1號(hào)，灰白色菌落編為2號(hào)，黑色菌落編為3號(hào))。 1.2.4 接種動(dòng)物。將病料組織接種普通肉湯后生長(zhǎng)的細(xì)菌，接種小白鼠，腹腔注射0.3mL/只，接種后觀察發(fā)病和死亡情況。 1.2.5 鏡檢。挑取SS瓊脂上的不同菌落和純化后的細(xì)菌肉湯分別涂片，革蘭氏染色，鏡檢。 1.2.6 藥敏試驗(yàn)。將純化的1、2、3號(hào)菌落按常規(guī)方法接種在SS瓊脂上，劃線，貼上藥敏紙片，37℃恒溫培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈的大小，記錄結(jié)果。 1.2.7 生化試驗(yàn)。將純化后的3種菌落，分別按常規(guī)方法接種于細(xì)菌微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)24h觀察7d，記錄結(jié)果。 2 結(jié)果 2.1 病料涂片 姬姆薩氏染色鏡檢，可見(jiàn)有大量散在的、單個(gè)的、纖細(xì)的染成淡紫色的細(xì)長(zhǎng)桿菌存在，3株純化菌涂片革蘭氏染色鏡檢，可見(jiàn)紅色、兩端鈍圓、散在短小桿菌。 2.2 病菌分離 培養(yǎng)在普通肉湯和胰蛋白胨肉湯中，可見(jiàn)均有細(xì)菌生長(zhǎng)、肉湯混濁、試
管底部有沉淀。接種SS瓊脂平板，可見(jiàn)有紅色、灰白色和頂端為黑色的3種菌落，細(xì)菌形態(tài)為光滑、濕潤(rùn)、隆起。 2.3 生化試驗(yàn) 培養(yǎng)分離的1號(hào)菌，能分解
葡萄糖、賴氨酸、衛(wèi)矛醇、枸椽酸，不產(chǎn)生H2S，不分解鳥(niǎo)氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、尿素、氨基酸；而2、3號(hào)菌，能分解葡萄糖、賴氨酸、衛(wèi)矛醇、鳥(niǎo)氨酸、氨基酸，產(chǎn)生H2S，但不發(fā)酵乳糖，也不分解蛋氨酸、苯丙氨酸，其中2號(hào)菌能分解尿素酶。 2.4 動(dòng)物接種 混合菌接種小白鼠，于十幾小時(shí)后小白鼠死亡，共死亡7只。剖解見(jiàn)
心包積液，小腸出血，心冠狀脂肪小點(diǎn)出血，并從死亡小白鼠心血中分離到混合接種菌。 2.5 藥敏試驗(yàn) 通過(guò)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌分離株（1號(hào)菌)和沙門(mén)氏桿菌分離株（2號(hào)強(qiáng)菌)，對(duì)頭孢噻肟、阿米卡星、壯觀霉素高敏，對(duì)青霉素、四環(huán)素等產(chǎn)生耐藥性。參照藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)。 3 討論與分析 病理剖檢可見(jiàn)，病鴨心肌出血、肝瘀血腫大、小腸出血；細(xì)菌染色鏡檢可見(jiàn)，兩端鈍圓的、散在的、短小桿菌；SS瓊脂培養(yǎng)基上，有圓形、光滑、濕潤(rùn)、隆起的菌落生長(zhǎng)；生化試驗(yàn)結(jié)果顯示：紅色、黑色和灰白色菌落都能分解葡萄糖、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸，且紅色菌落能分解乳糖，黑色菌落和灰白色菌落能產(chǎn)生H2S。由此確診該野鴨為大腸桿菌和沙門(mén)氏菌混合感染。 從生化試驗(yàn)結(jié)果可以看出，本次分離的紅色菌落能分解葡萄糖、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、乳糖，不產(chǎn)生H2S，不分解尿素酶（與方定一對(duì)大腸桿菌生化試驗(yàn)結(jié)果基本一致)；但分離的紅色菌落不分解鳥(niǎo)氨酸，這可能與不同菌株的大腸桿菌有關(guān)。分離的黑色菌落和灰白色菌落能分解葡萄糖、賴氨酸，不發(fā)酵乳糖，不分解尿素酶，對(duì)苯內(nèi)氨酸不脫氨（與董國(guó)雄報(bào)道的沙門(mén)氏菌生化試驗(yàn)結(jié)果基本一致)；但本次的沙門(mén)氏桿菌分離株能水解尿素酶，這可能與沙門(mén)氏菌的血清型不同有關(guān)。 藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明：本試驗(yàn)的3株分離菌，對(duì)頭孢噻肟、頭孢呋新、環(huán)丙沙星、卡那霉素呈現(xiàn)高敏。除此之外，大腸桿菌分離株還對(duì)壯觀霉素、丁胺卡那霉素高敏，但對(duì)四環(huán)素、妥布霉素出現(xiàn)耐藥；沙門(mén)氏菌分離株，還對(duì)壯觀霉素、妥布霉素高敏，但對(duì)四環(huán)素中敏和對(duì)青霉素、桿菌肽和萬(wàn)古霉素產(chǎn)生耐藥。引起這些結(jié)果的原因，可能與大腸桿菌和沙門(mén)氏桿菌的血清型不同或長(zhǎng)期用藥的原因，這在周倫江、龍虎、張健、程安春、張文慧的研究中有類似的報(bào)道。 藥敏試驗(yàn)表明，本次分離到的大腸桿菌和沙門(mén)氏桿菌，對(duì)頭孢類藥物最敏感，所以給野鴨群投以復(fù)方先鋒霉素（頭孢唑啉)后病情得到了控制。因此，在診療中，宜及時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇高敏藥物治療，可達(dá)到較好效果。
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