| 公開(公告)號 | CN1260367C |
| 公開(公告)日 | 2006.06.21 |
| 申請(專利)號 | CN03150240.7 |
| 申請日期 | 2003.07.22 |
| 專利名稱 | 具有抑制血管生成及抗腫瘤作用的強(qiáng)化融合蛋白Fv-LDP-AE |
| 主分類號 | C12P21/04(2006.01)I |
| 分類號 | C12P21/04(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C07K19/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 李 亮;甄永蘇;苗慶芳;尚伯楊;劉秀均;江 敏 |
| 地址 | 100050北京市宣武區(qū)天壇西里1號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 北京華科聯(lián)合專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 楊 厚;王 為 |
| 國省代碼 | 北京;11 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種高表達(dá)強(qiáng)化融合蛋白Fv-LDP-AE的制備方法，其特征在于所說方法采用DNA重組和分子強(qiáng)化兩條技術(shù)路線，具體步驟如下：A.力達(dá)霉素輔基蛋白LDP與抗IV型膠原酶單鏈抗體scFv的融合基因構(gòu)建；B.融合蛋白大腸桿菌重組表達(dá)質(zhì)粒pEFL的構(gòu)建，是用基因工程技術(shù)分別克隆得到力達(dá)霉素輔基蛋白LDP基因和IV型膠原酶單鏈抗體scFv基因，將二者以編碼一段柔性小肽的DNA序列相連構(gòu)建成scFv-spacer-LDP形式的融合基因，同時在spacer區(qū)引入特異性酶切位點(diǎn)，克隆至高效表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)，篩選獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pEFL；C.融合蛋白Fv-LDP在大腸桿菌CAMS/FLDFP(保藏編號：CGMCCNo.0960)中的誘導(dǎo)表達(dá)，是將重組表達(dá)質(zhì)粒pEFL轉(zhuǎn)化入高效表達(dá)的大腸桿菌宿主菌BL21(DE3)starTM獲得重組轉(zhuǎn)化菌，經(jīng)終濃度為0.8mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4-6小時，獲得包涵體形式的融合蛋白Fv-LDP，并進(jìn)行條件優(yōu)化獲得最佳表達(dá)，其蛋白表達(dá)量為30％；D.融合蛋白Fv-LDP的親和層析純化與分離，是通過金屬螯合親和柱純化融合蛋白Fv-LDP，將變性蛋白樣品上柱，用1×BindingBuffer沖洗親和柱，除去大部分雜蛋白，再用1×washingbuffer洗滌層析柱，除去少部分雜蛋白，最后以1×EluteBuffer進(jìn)行洗脫，收集洗脫組份獲得純化后的融合蛋白，再進(jìn)行透析，復(fù)性，脫鹽，冷凍干燥，于-70℃保存，用于制備功能性融合蛋白；E.強(qiáng)化融合蛋白Fv-LDP-AE的制備分離，是將純化分離得到的融合蛋白Fv-LDP與5倍分子量經(jīng)甲醇提取制備的力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)活性型烯二炔AE，混合振搖，室溫放置12小時進(jìn)行分子強(qiáng)化，將混合液以PD-10柱層析分離，經(jīng)A280nm紫外監(jiān)測后，棄過量未反應(yīng)的AE，獲得強(qiáng)化融合蛋白Fv-LDP-AE。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤作用的強(qiáng)化融合蛋白Fv-LDP-AE，主要通過融合蛋白的基因工程構(gòu)建和分子強(qiáng)化兩條技術(shù)路線制備而成，融合蛋白Fv-LDP的基因全長1119bp，編碼372個氨基酸，分子量為38.7kDa，它對腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用，能明顯抑制雞胚尿囊膜新生血管的生成，動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其對小鼠移植性肝癌H22有非常顯著的療效，使用可耐受劑量，其抑瘤率可達(dá)95.9％(P＜0.001)，該強(qiáng)化融合蛋白顯示了抗體靶向藥物的小型化與高效化特點(diǎn)，可望成為一種用于臨床治療腫瘤的新型靶向藥物。 |
| 國際公布 |
