四、其他載體
現(xiàn)在提到的分子載體有的不是用于克隆某基因，而是作為外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運載工具。
�。ㄒ�)轉(zhuǎn)座子載體
這里主要提一下有關(guān)果蠅轉(zhuǎn)座因子（P因子)作為基因載體。因為這是很有希望的真核生物基因工程的載體，果蠅的P因子約長3kb，每端各有反向重復(fù)順序，當(dāng)它插入基因組時，可以激活或滅活近旁的基因，當(dāng)它從基因組上切下來時，也可能把近旁的基因或DNA順序一起切下而引起突變。現(xiàn)在已能把帶有某種限制酶切點的P因子克隆到質(zhì)粒pBR322中，然后在P因子酶切點上插入外源DNA。經(jīng)過擴增后，將這種重組DNA用微量注射儀直接注入果蠅的受精卵中。結(jié)果所克隆的基因能隨P因子插入受體細(xì)胞的基因里，并且得到表達(dá)。
（二)人工微小染色體
包括人體在內(nèi)的高等生物基因工程中遇到的一個難題是缺乏合適的基因載體。要求載體對受體細(xì)胞沒有危害，能安全、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)給后代，使基因的性狀得到連續(xù)的表達(dá)。這對校正某種遺傳缺陷或改進(jìn)某種性狀都是十分有用的。目前一些實驗室正致力于構(gòu)建人工微小染色體（microchromosome)。
構(gòu)建染色體應(yīng)包括：基因、復(fù)制起點、著絲粒和端粒。染色體上需帶有基因是不言而喻的。復(fù)制起點是染色體復(fù)制所不可缺少的。著絲粒保證復(fù)制后的染色體均等地分配到兩個子細(xì)胞中。端粒具有某種特定結(jié)構(gòu)以保證染色體的個體性。
首先，構(gòu)建的是酵母的人工微小染色體。天然的酵母染色體為150～1000kb。人工構(gòu)建的微小染色體長55kb，在細(xì)胞內(nèi)很穩(wěn)定，只是每個細(xì)胞里的拷貝數(shù)很少。比如已構(gòu)成的人工微小染色體為7～15kb，每個細(xì)胞里的拷貝數(shù)雖然增多，但不夠穩(wěn)定。
人工構(gòu)建酵母微小染色體的具體步驟見圖23-6。從圖中可以看到，先用質(zhì)粒pBR322為材料，連接酵母的標(biāo)記基因Leu2（亮氨酸)后去轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后再接上酵母染色體上分離得到的著絲粒CEN3，再去轉(zhuǎn)化大腸桿菌以增殖重組質(zhì)粒，取得下一步實驗用的DNA。接下去是連接從酵母（真核生物)中分離得到的ARS1。ARS是指自主復(fù)制順序（autonomously replicat－ing sequence)，這個順序中可能包含著復(fù)制起點。目前已從非洲爪蟾的線粒DNA，衣藻和煙草葉綠體和核DNA中分離ARS。最后一個步驟是接上染色體端粒。用的是四膜蟲（Te－trahymena)的rDNA末端（Tr末端)。這樣構(gòu)建成的質(zhì)粒去轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)斷開成為線狀重組DNA分子，可以象天然染色體一樣地復(fù)制和分離，這就是酵母線狀質(zhì)粒YLp4。
圖23-6 構(gòu)建酵母人工微小染色體的步驟
