二、噬菌體和病毒載體
噬菌體λ是最主要的一種載體。自從1974年以來(lái)，已用野生型λ改造和構(gòu)建出一系列噬菌體載體。
噬菌體λ是溫和噬菌體。基因組是長(zhǎng)約50kb的雙鏈DNA分子。在噬菌體λ顆粒中，DNA是線狀雙鏈分子帶有單鏈的互補(bǔ)末端。末端長(zhǎng)12個(gè)核苷酸，這稱為粘性末端，簡(jiǎn)寫COS。當(dāng)噬菌體感染宿主細(xì)胞后，雙鏈DNA分子通過(guò)COS而成環(huán)狀。在感染早期，環(huán)狀DNA分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。在此期間，噬菌體有兩條復(fù)制途徑可供選擇：一是裂解生長(zhǎng)。環(huán)狀DNA分子在宿主細(xì)胞里復(fù)制若干次，合成了大量的噬菌體基因產(chǎn)物，形成子代噬菌體顆粒，成熟后使細(xì)菌裂解，釋放出許多新的有感染能力的病毒顆粒。另一是溶源性生長(zhǎng)。噬菌體DNA整合進(jìn)宿主菌的基因組，然后象細(xì)菌染色體上的基因一樣進(jìn)行復(fù)制，并傳遞給下一代細(xì)菌。
�。ㄒ�)噬菌體λ載體的構(gòu)建
野生型噬菌體λDNA全長(zhǎng)約50kb，上有65種限制酶酶切點(diǎn)，除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7種限制酶各有一個(gè)切點(diǎn)外，其余都多于2個(gè)。有些酶切點(diǎn)在λ增殖所必需的基因區(qū)域內(nèi)。因此，噬菌體λ必須經(jīng)過(guò)改造才能用作載體。現(xiàn)在用的λ載體大都除去了某種限制酶的酶切點(diǎn)。因此，作為載體的噬菌體λ都短于野生型。
噬菌體λ載體有兩種類型：①插入型。由于改建后的噬菌體λDNA都短于野生型，所以可插入外源DNA。只要插入的位置不影響噬菌體增殖。而且噬菌體DNA缺失越長(zhǎng)，插入片段就可越大。②置換型。噬菌體λ的基因組可分為三個(gè)區(qū)域，左側(cè)區(qū)包括使噬菌體DNA成為一個(gè)成熟的、有外殼的病毒顆粒所需的全部基因，全長(zhǎng)約20kb。右側(cè)區(qū)內(nèi)包含所有的調(diào)控因子、與DNA復(fù)制及裂解宿主菌有關(guān)的基因，這個(gè)區(qū)域約長(zhǎng)12kb。中間區(qū)域約長(zhǎng)18kb，這一段DNA可以被外源置換而不會(huì)影響噬菌體λ裂解生長(zhǎng)的能力。置換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。醫(yī)學(xué)全在線www.med126.com
噬菌體λ裂解生長(zhǎng)的能力同包裝在頭蛋白中的λDNA的大小有關(guān)。當(dāng)DNA的長(zhǎng)度短于野生型的78%或超過(guò)105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此要求λ載體DNA和外源DNA長(zhǎng)度之和在39～53kb之間。
置換型載體DNA用選定的限制酶完全酶切后，要設(shè)法除去中間片段，只留下左臂和右臂以便用外源DNA片段連接，包裝成重組噬噬體。這是因?yàn)樽蟊酆陀冶叟c中間片段間都有單鏈“粘性末端”，在連接酶作用下可以重新恢復(fù)原來(lái)的結(jié)構(gòu)，從而影響了同外源DNA的連接。區(qū)分重組噬菌體形成的噬菌斑和重新恢復(fù)的載體噬菌體形成的噬菌斑的方法是用Xgal藍(lán)色噬菌斑試驗(yàn)。有些噬菌體載體的中間片段帶有編碼β半乳糖苷酸的基因。當(dāng)這種噬菌體感染lac宿主細(xì)胞并在含有Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，半乳糖苷酸與Xgal反應(yīng)的產(chǎn)物為不溶性的靛藍(lán)染料。因此，含有中間片段的重新恢復(fù)的噬菌體形成藍(lán)色噬菌斑；而同外源DNA連接的重組噬菌體形成的噬菌斑是無(wú)色透明的。
�。ǘ�)單鏈?zhǔn)删w載體
最常用的單鏈?zhǔn)删w載體是M13和它的改建噬菌體。M13是絲狀噬菌體，有長(zhǎng)約6500個(gè)核苷酸的閉環(huán)DNA基因組。M13附著在大腸桿菌的F性菌毛上，所以它們只能感染雄性細(xì)菌，即F’或Hfr細(xì)菌。當(dāng)噬菌體進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，單鏈的噬菌體DNA轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制型（RF)。從細(xì)胞中分離的RF可用作克隆雙鏈DNA的載體。當(dāng)每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞里積聚了200到300份RF型拷貝時(shí)，M13開始不對(duì)稱的合成，即只大量合成DNA雙鏈中的一條鏈。單鏈DNA摻入成熟的噬菌體顆粒，顆粒不斷地從感染細(xì)胞上芽生。M13感染雖不殺死細(xì)胞，但細(xì)胞的生長(zhǎng)受到一定的抑制，所以形成混濁的噬菌斑。
M13的基因組中除有一段507個(gè)核苷酸，其余都含有與其復(fù)制有關(guān)的遺傳信息。因此，只有在這一段中可插入外源DNA而不致影響噬菌體的活性。用M13作為分子克隆載體的優(yōu)點(diǎn)是從細(xì)菌中釋放出來(lái)的噬菌體顆粒只含單鏈DNA，其中包含了克隆DNA片段的二條互補(bǔ)鏈中的一條，因此可用來(lái)作為對(duì)DNA測(cè)序的模板。另外，可用來(lái)產(chǎn)生單鏈的DNA探針以選擇和分離互補(bǔ)的RNA。M13的RF型是雙鏈DNA，便于限制酶的識(shí)別和切割，克隆進(jìn)雙鏈的外源DNA。從細(xì)菌培養(yǎng)液中大量抽取單鏈DNA。問(wèn)題是插入M13的外源DNA超1000bp時(shí)就不穩(wěn)定，在噬菌體增殖時(shí)會(huì)出現(xiàn)缺失。一般說(shuō)，插入300～400bp是相當(dāng)穩(wěn)定的。
