�。ㄎ�)免疫熒光法
免疫熒光法（immunofluorescent method，IF)是借抗原抗體反應進行特異熒光染色的診斷技術。最常用的熒光素為異硫氰基熒光素（fluorescein isothiocynate，FITC)。常用于寄生蟲感染的熒光抗體染色有直接法與間接法。
1．直接法 用于檢測抗原，其缺點是每查一種抗原必須制備與其相應的熒光標記的抗體。目前很少應用。
2．間接法 也稱間接熒光抗體法（indirect fluorescent antibody method，IFA)。將抗原與未標記的特異性抗體（如患者血清)結合，然后使之與熒光標記的抗免疫球蛋白抗體（抗抗體)結合，三者的復合物可發(fā)出熒光。本法的優(yōu)點是制備一種熒光標記的抗體，可以用于多種抗原，抗體系統(tǒng)的檢查，即可用以測定抗原，也可用來測定抗體。IFA的抗原可用蟲體或含蟲體的組織切片或涂片，經充分干燥后低溫長期保存?zhèn)溆�。一張載片可等距置放多個抗原位點用以同時檢測多個樣本或確定滴度。醫(yī)學全在線www.med126.com
IFA的操作步驟如下：①抗原標本：用記號筆或蠟筆將各個抗原位點圍圈隔離；②在每個抗原位置滴加已稀釋的血清樣本或樣本稀釋系列，使樣本液充滿圈內，置濕匣37℃孵育30分鐘；③用pH8.00.01mol／L PBS沖后再置同樣PBS液中浸泡5分鐘，不時搖動，如此2遍，然后取出吹干；④在抗原位點滴加經pH8.0PBS適當稀釋的羊抗人IgG熒光抗體（每批結合物的工作濃度需經滴定)，使完全覆蓋抗原膜，置濕盒37℃孵育30分鐘；⑤經洗滌（同③)后用0.1‰伊文思藍液復染10分鐘，然后以PBS流水沖洗0.5～1分鐘，風干；⑥用pH8.5或pH8.0碳酸（或磷酸)緩沖甘油封片，也可加一小滴PBS（pH8.0)覆以蓋片鏡檢。鏡檢應及時進行以免疫光衰變�？墒褂脽晒夤庠椿蜉p便熒光光源，配以適合的激發(fā)濾片和吸收濾片，在低倍或高倍鏡下檢查。以見有符合被檢物形態(tài)結構的黃綠色清晰熒光發(fā)適合的激發(fā)濾片和吸收濾片，在低倍或高倍鏡下檢查。以見有符合被檢物形態(tài)結構的黃綠色清晰熒光發(fā)光體、而陰性對照不可見者為陽性反應。根據熒光亮度及被檢物形態(tài)輪廓的清晰度把反應強度按5級區(qū)別（＋＋＋，＋＋，＋，±，－)。＋以上的熒光強度為陽性。
該法具有較高的敏感性、特異性和重現性，應用抗原經濟。國內外廣泛應用于寄生蟲病的血清學診斷方法，血清流行病學調查和監(jiān)測疫情的方法，如主要用于診斷瘧疾、絲蟲病及血吸蟲病，也有用于肺吸蟲病、華支睪吸蟲病、包蟲病及弓形蟲病的血清學診斷。
近10年來，國內學者對IFA進行了很多改進。李允鶴等（1984，1988)通過深入研究，確定了感染鼠肝細胞內蟲卵冰凍切片為IFA較為理想的診斷抗原。該法需用熒光顯微鏡判斷結果，限制了它的應用范圍。但是應用該法時必須具備的熒光抗體，目前國內已有商品供應，這為IFA的擴大應用，提供了條件。
（六)對流免疫電泳試驗
對流免疫電泳試驗（counter-immunao electrophoretic assay，CIE)以瓊脂或瓊脂糖凝膠為基質的一種快速，敏感的電泳技術。
對流電泳較簡單的擴散法和常規(guī)免疫電泳法至少敏感10～20倍，省時，省料，可用已知抗原檢測抗體或相反，反應結果特異，陽性反應的可信度高，適用范圍廣。近年來本法的改進已試用酶或放射標記的反應配體，如酶標記抗原對流免疫電泳（ELACIE)、放射對流免疫電泳自顯影術（RCIEA)等。以克服電泳技術本身不夠靈敏的弱點，國內在血吸蟲病、肺吸蟲病免疫診斷已獲良好結果。國外報道應用于阿米巴病、錐蟲病、棘球蚴病、旋毛蚴病、血吸蟲病等血清學診斷。
（七)酶聯免疫吸附試驗
酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay．ELISA)簡稱酶聯試驗，已廣泛用于多種寄生蟲感染的宿主體液（血清，腦脊液等)以及排泄分泌物（尿，乳，糞便等)內特異抗體或抗原微粒的檢測。根據檢測要求，試驗可分多種類型，常用者有：用于檢測抗體的間接法；檢測IgM的雙夾心法；檢測抗原的雙抗體夾心法；以固相抗體檢測抗原的競爭法以及競爭抑制法等（圖21－8)。
圖21－8 酶聯免疫吸附試驗常用方法示意圖
酶聯試驗的方法根據所用載體、酶底物系統(tǒng)、觀察反應結果等不同而有很大差別。目前最常用的固相載體為聚苯乙稀微量滴定板，具有需樣少，敏感，重演性好，使用方便等優(yōu)點。酶底物系統(tǒng)也有多種，常用的有辣根過氧化物酶－鄰苯二胺（HRP－OPD)、堿性磷酸酯酶－硝酚磷酸鹽（AKP－PNP)等，具有較好的生物放大效應。其中HRP由于價廉、易得而被廣泛應用。
酶聯試驗的基本操作過程可分為：①固相包被；②溫育洗滌；③加樣；④酶結合物反應；⑤底物顯色；⑥終止反應讀取結果等若干步驟。溫育和洗滌需貫穿在每二步驟之間，用以去除多余的反應物。以下為臨床上最常用的間接法（檢測抗體)和雙抗體夾心法（檢測抗原)的操作程序：
�、砰g接法：
1)以包被液（碳酸鈉－碳酸氫鈉緩沖液0.05mol／L，pH9.6)稀釋抗原（常用5～10µg/ml)，每孔0.1（或0.2)ml包被反應板，37℃濕盒溫育2～3小時或4℃過夜；
2)棄去包被液，反應板用去離子水或PBS－Tween液（0.005mol／L PBS含0.05％Tween-20)沖洗3次，甩干；
3)用樣本稀釋液（0.05mol／L PBS含0.05％Tween-20)稀釋樣本（起始濃度≥100－1)，用樣本稀釋液（每孔0.1（或0.2)ml，溫育1小時；
4)棄去樣液，如上沖洗，甩干加稀釋結合物（市售品常稀釋至100－1，用樣本稀釋液)，每孔0.1（或0.2)ml，溫育1～2小時；
5)如上沖洗甩干后即刻加入新鮮配制的底物系統(tǒng)，每孔0.1（或0.2)ml，置暗盒室溫15分鐘；
6)終止反應：HRP－OPD系統(tǒng)每孔加1mol／LH2SO450µl；
7)目測或用分光光度計在400µm波段測定吸收值來判斷。
�、齐p抗體夾心法：
1)以包被液稀釋抗體（如兔抗血吸蟲蟲卵可溶性抗原的抗體，抗SEA－IgG)包被反應板（1～1000µg/ml)，方法同間接法包被抗原；
2)沖洗，甩干，加樣溫育同前（起始濃度≥5－1)；
3)加結合物（例如抗SEA－IgG－HRP)，適宜工作濃度需先經方陣滴定確定；
4)以下各步同間接法。
若包被抗體與第二抗體來自不同種的供體則可應用市售抗免疫球蛋白結合物。例如包被抗體為羊抗SEA，二抗用兔抗SEA則在未標記的二抗溫育洗滌后加羊抗兔IgG結合物（GAP－HRP)。
[附]酶標記物制備：應用抗原或抗體與酶分子的交聯技術，交聯物亦稱酶結合物（conjugate)。根據酶與抗體（抗原)的激活順序，交聯反應可分一步法、二步法及三步法不等。其中以二步法中的過碘酸鈉法多用，戊二醛一步法反應率較低，較適用于交聯AKP。免疫球蛋白標記辣根過氧化物酶（過碘酸鈉法)與免疫球蛋白標記堿性磷酸脂酶（戊二醛一步法)，按常規(guī)方法制備。
抗IgG型抗體酶結合物也可用金黃色葡萄球菌A－蛋白酶結合物替代，稱A－蛋白酶聯試驗（SPA－ELISA)。A－蛋白辣根過氧化物酶結合物（PA－HRP)已有市售標準品，其敏感度稍遜于抗體酶結合物。
底物配制：不同的酶要求選擇相應底物，以下為分別適用于比色和肉眼讀取結果的兩種HRP常用底物配制。
鄰苯二胺（OPD)：經HRP催化后生成橘紅色產物。40mgOPD溶于檸檬酸磷酸緩沖液（pH5.0)100ml（含24.3ml 0.1mol／L檸檬酸，25.7ml0.02mol／L Na2HPO4加水50ml)，臨用前加30％H2O20.15ml，溫育15分鐘后用2mol／l H2SO4終止反應，492nm讀數。本底物具高度敏感性，顯色梯度良好，生成可溶性產物，有利于比色讀數，但為光敏感，反應時應置暗盒內；也具致突變作用。醫(yī)學 全在.線提供
5－氨基水楊酸（5AS)：經HRP催化生成棕色產物。8mg5AS溶于10ml50℃溫熱蒸餾水中，置4℃暗處不超過3天，臨用前以1n NaOH調pH至6.0，加0.05％H2O2 1ml。37℃經30～60分鐘溫浴后用1n NaOH終止反應，肉眼或449nm比色。本底物無致突變作用，生成棕褐色不全溶解的產物有利于肉眼判讀結果。
酶聯試驗為高靈敏檢測技術，結果可定量表示，可檢測抗體、抗原或特異性免疫復合物，微量滴定板法消耗樣本試劑少，能供全自動操作，適用批量樣本檢測，因此在寄生蟲感染的研究和診斷領域乃至血清流行病學均被廣泛應用。國內外有多種寄生蟲感染的酶聯藥籍出售，包括有血吸蟲病、弓形蟲病、阿米巴病、絲蟲病、蛔蟲病、旋毛蟲病和犬蛔蟲病等，ELISA可用作輔助診斷病人，血清流行病學調查和監(jiān)測疫情的方法。酶聯試驗操作程序的簡單快速不如IHA，但方法具有很大所改良潛力和適應范圍。判斷結果需用分光光度計，限制了擴大應用；另外，應用抗原及酶結合物尚需進一步標準化，操作方法也應規(guī)范化。
近年來已有多種改進的酶聯免疫吸附試驗如①快速－ELISA：改進特點為用PVC薄膜代替聚苯乙烯微量反應板作載體；將1％可溶性血吸蟲卵抗原與尿素溶解性血吸蟲卵抗原等量相混合預吸附于薄膜上；用抗人Igg McAb代替羊抗人IgG制備酶結合物；用底物TMB代替OPD。該法主要以目視法判斷結果，整個操作流程僅需20min左右。②硫酸銨沉淀抗原－ELISA：可溶性血吸蟲卵抗原經飽和硫酸銨沉淀后用作ELISA診斷抗原；在系列實驗基礎上，使操作方法達到規(guī)范化；用質量控制圖控制檢測差異，并以標準曲線單位判斷結果；縮短檢測時間，節(jié)省檢測時間，節(jié)省試液用量，提高了敏感性，特異性和重現性。
