細(xì)胞和分子免疫學(xué):第八節(jié)　淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中常用方法

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是目前分子免疫學(xué)中研究的熱點(diǎn)。免疫學(xué)中所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要包括淋巴細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其研究手段多種多樣，包括細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)以及蛋白質(zhì)化學(xué)等技術(shù)。本節(jié)將扼要介紹目前信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中常用的方法和技術(shù)。

一、磷酸化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的鑒定

在淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)地過(guò)程中可發(fā)生多種蛋白底物的磷酸化，包括酪氨酸磷酸化、蘇氨酸殘基磷酸化及絲氨酸殘基磷酸www.med126.com化。它們分別由不同的蛋白激酶所催化。這些磷酸化蛋白通常都為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。一些信號(hào)蛋白結(jié)構(gòu)中含SH-2結(jié)構(gòu)域可同某些磷酸化的酪氨酸殘基相結(jié)合，使信號(hào)得以逐級(jí)傳遞。含酪氨酸磷酸化的蛋白鑒定通常是首先分離粗提蛋白，采用針對(duì)含這些氨基酸殘基磷酸化蛋白的單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀�。╥mmunoprecipitation)，SDS-PAGE電泳，然而采用Western blotting及immunoblotting鑒定其分子量，進(jìn)一步利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆信號(hào)蛋白，搞清其基因結(jié)構(gòu)和氨基酸序列。

二、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中第二信使含量的測(cè)定

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，第二信使（second messenger)含量的高低同信號(hào)傳遞密切相關(guān)。目前測(cè)定的第二信使主要包括細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺（[Ca²⁺]i)、二�；�甘油（DAG)、三磷酸肌醇（IP3)以及環(huán)腺苷酸（cAMP)等。

1.[Ca²⁺]i的測(cè)定　細(xì)胞內(nèi)Ca²⁺的測(cè)定方法有原子吸收光譜法、離子微電極測(cè)定法、放射示蹤法及標(biāo)記示蹤法等。目前常用標(biāo)記示蹤法，即用熒光探針標(biāo)記靶細(xì)胞。常用的熒光探針有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等。Fura-2/Am和Indo-1較為敏感。

2.IP3的測(cè)定　采用³H-TdR標(biāo)記的肌醇標(biāo)記靶細(xì)胞后，用不同的刺激劑刺激細(xì)胞，分離磷脂酰肌醇混合物，通過(guò)陰離子交換層析柱（Serva公司Dowex1*8)分離洗脫，收集IP3洗脫峰后進(jìn)行液閃測(cè)定。此外，還可以使用Amersham公司生產(chǎn)的D-myo-IP3[³H]分析系統(tǒng)直接測(cè)定粗提物中的IP3含量，此方法簡(jiǎn)易、敏感。

3.DAG的測(cè)定　首先提取含DAG的樣品，然后采用Amersham公司生產(chǎn)的DAG分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。此系統(tǒng)測(cè)定的原理是用DAG激酶催化底物DAG，使之發(fā)生磷酸化，外源加入³²γ-ATP，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離后測(cè)定放射性含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出樣品中DAG的含量。

4.cAMP的測(cè)定　可選擇不同的方法：（1)cAMP[³H]分析系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是放射性半衰期長(zhǎng)，可用于大量樣品的分析；（2)cAMP[¹²⁵I]分析系統(tǒng)，用于小量樣品的分析；（3)cAMp ILISA測(cè)定方法，此方法簡(jiǎn)便、敏感。

三、激酶活性的測(cè)定

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中往往涉及多種激酶的活化，因而對(duì)這些激酶活性的測(cè)定可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的一種重要指標(biāo)。常見(jiàn)激酶活性的測(cè)定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的試劑盒。檢測(cè)原理是根據(jù)激酶可以催化特定底物發(fā)生磷酸化，外源加入³²γ-ATP，通過(guò)分離反應(yīng)產(chǎn)物后測(cè)定放射活性，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)推算出樣品酶的活性。前已提及，PKC從胞質(zhì)向胞膜的轉(zhuǎn)位是PKC活化的一個(gè)重要指標(biāo)，因而分離胞質(zhì)和胞膜中的PKC并分別測(cè)定其活性，計(jì)算胞膜上PKC活性占總PKC活性的比例，從而判定PKC的活化程度。

四、細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的分離和鑒定

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果是細(xì)胞核內(nèi)一些轉(zhuǎn)錄因子同DNA上某些特定的序列結(jié)合，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性和基因的表達(dá)水平。因而分離鑒定細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中具有獨(dú)特的意義。根據(jù)核轉(zhuǎn)錄因子可與一些特定的核甘酸序列結(jié)合的特點(diǎn)，將其特定的核苷序列標(biāo)記上同位素，來(lái)鑒定信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的核轉(zhuǎn)錄因子。核轉(zhuǎn)錄因子具有一些特征性的結(jié)構(gòu)域，即亮氨酸拉鏈（lucine zipper)、鋅指結(jié)構(gòu)（zinc finger)和螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix)結(jié)構(gòu)。并且受用足跡法（foot printing)分析新發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA的位置和核甘酸序列。

隨著分子生物學(xué)核技術(shù)的發(fā)展，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究取得很大進(jìn)展。采用基因克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的信號(hào)蛋白分子；嵌合分子的構(gòu)建及基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)的應(yīng)用為細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究提供了有效的手段；點(diǎn)突變、肽競(jìng)爭(zhēng)等技術(shù)使信號(hào)蛋白中某些功能區(qū)的作用的研究變得更為精確。

（夏海濱 金伯泉)