實用免疫細胞與核酸:第七節(jié)　光鏡免疫金銀細胞化學(xué)方法

一、免疫金染色

（一)免疫金法（IGS)

1987年，Geoghegan等首次應(yīng)用免疫金探針檢測B淋巴細胞表面抗原，建立了用于光鏡水平的免疫金法（Immunogold staining, IGS)。IGS的特點是染色程序簡便，不要顯色，就能檢測細胞表面的抗原，又能檢測細胞內(nèi)抗原。染色時免疫金法一般要求金顆粒的直徑大于20nm，并且用的濃度較高。用IGS定位細胞抗原時一般都采用間接法，下面以人肝組織HBsAg的定位為例說明IGS的步驟：

（1)石蠟切片→脫蠟至水。

（2)0.1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。

（3)用雙蒸水振洗5＇×2。

（4)用0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。

（5)1%卵蛋白（EA)封閉10min。

（6)稀釋鼠抗HBsAg單克隆抗體（用0.02mol/l TBS pH8.2 作1：100稀釋)，4^℃過夜。

（7)0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。

（8)1%EA封閉10min。

（9)0.02mol/l TBS pH8.2 稀釋兔抗鼠金標(biāo)抗體（1：8)37℃45min。

（10)0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。

（11)雙蒸水振洗5＇×2。

（12)1%戊二醛，10min。

（13)雙蒸水5min 。

（14)用蘇木素襯染核1min，甘油封片。

結(jié)果：在光鏡下可見部分肝細胞漿內(nèi)有金顆粒聚集呈紅色，沿細胞膜分布，表明有HBsAg定jfsoft.net.cn/hushi/位在細胞漿內(nèi)。

（二)蛋白A-金（PAG)放大法

為了得到更明確的染色結(jié)果，在用IGS方法定位細胞抗原時可采用搭橋法，使IGS得到放大，這里介紹一種用抗A蛋白抗體作橋的PAG放大法。下面以5-羥色胺定位為例說明這一新方法。

（1)石蠟切片→脫蠟至水。

（2)1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。

（3)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。

（4)1%EA封閉組織10min。

（5)用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀釋兔抗5-羥色胺抗體（1：1000)4℃過夜，或者37℃1h。

（6)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。

（7)1%EA封閉10min。

（8)用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀釋PAG（1：40)，37^℃1h。

（9)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。

（10)1%EA封閉10min。

（11)抗A蛋白抗體（1：100)37^℃。45min。

（12)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。

（13)加0.05mol/l pH7.4 TBS稀釋PAG（1：40)，37℃45min。

（14)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。

（15)雙蒸水振洗5min。

（16)1%戊二醛10min。

（17)雙蒸水振洗5min。

（18)0.01%伊文思藍2min，甘油封片。

光鏡下觀察，小腸粘膜內(nèi)含有嗜銀顆粒的細胞胞漿呈紅色，陽性顆粒位于細胞核底部，比單純用PAG染色深度得到加深，陽性結(jié)果得到放大。由于抗A蛋白抗體既能通過Fab段又能夠通過Fc段與PAG上的A蛋白結(jié)合，因此，與其它橋抗體相比它能夠在抗原位點處聚集更多的膠體金顆粒�；�本原理如下圖5-3。

圖5-3 PAG放大法原理

PAG放大法的優(yōu)點：①使用試劑單一；②可大大提高IGS的敏感性，從而使應(yīng)用IGS方法定位抗原時使用高稀釋度的抗體成為可能；③背景干凈�？梢灶A(yù)見這一新方法將很快受到人們的關(guān)注。

二、免疫金銀法

1983年，Holgate等人將IGS與銀顯影方法相結(jié)合創(chuàng)立了免疫金銀法（Immunogold—sliver staining, IGSS)IGSS的基本原理是通過免疫反應(yīng)沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用對苯二酚還原劑將銀離子（Ag⁺)還原成銀原子（Ag^o)。被還原的銀原子于是圍繞金顆粒形成一個“銀殼”，“銀殼”一旦形成本身亦具有催化作用，從而使更多銀離子還原并促使“銀殼”越長越大“，最終抗原位置得到清楚放大。請參見圖5-4。

圖5-4　用銀增敏示意圖

（一)石蠟切片的IGSS染色

以人肝細胞內(nèi)HBsAg定位舉例說明。

（1)切片常規(guī)脫蠟至水。

（2)Lugol＇s液，5min.

（3)5%硫代硫酸鈉水溶液脫碘5min。

（4)用雙蒸餾水沖洗干凈。

（5)0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min兩次。

（6)用0.1%胰蛋白酶消化10min或用3mol/L尿素消化20min。

（7)0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min一次。

（8)1%卵白蛋白封閉15min。

（9)馬抗HBsAg抗體1：1000稀釋，37^℃1～2h 或4℃過夜。

（10)0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min兩次。

（11)1%卵白蛋白封閉10min。

（12)1：40，PAG，37℃45min。

（13)0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min兩次。

（14)雙蒸水洗5min，兩次。

（15)物理顯影見后所述。

（16)雙蒸水洗5min，兩次。

（17)蘇木素襯染。

（18)酒精常規(guī)脫水，透明，封固。

結(jié)果，光鏡下見肝細胞胞漿內(nèi)有膜或包涵體形分布的陽性黑色狀顆粒，背景干凈。

（二)冰凍切片的IGSS染色

作冰凍切片的組織，若在動物試驗可以先經(jīng)過固定液灌注或浸泡固定，也可不固定先做冰凍切片。人的組織也可通過浸泡固定或不固定，這主要根據(jù)保存抗原性的需要而定。固定過的組織可用20%蔗糖PBS（0.01mol/l pH7.2)浸泡2～4h或在切片時用OCT包埋，以減少冰凍切片過程中冰晶的形成。如果切片還準(zhǔn)備用于電鏡包埋，則可經(jīng)過5%，10%，20%濃度逐級遞增的蔗糖溶液。在冰凍切片前，可先入氟里昂–22 （Freon--22)驟冷，這樣可使組織的結(jié)構(gòu)保存更好，適用于電鏡觀察。

（1)冰凍切片。

（2)Lugol＇s液，5min.

以下步驟同人肝HBsAg的染色方法。

（三)半薄切片的IGSS染色

IGSS染色的半薄切片，可以在光鏡下直接觀察陽性結(jié)果，為電鐿取陽性部位及觀察打下良好的基礎(chǔ)。環(huán)氧樹脂會妨礙免疫組化染色。經(jīng)過餓酸處理后固定的組織同樣也會影響抗原抗體反應(yīng)，因此，半薄切片作IGSS染色劑，應(yīng)作以下處理。

（1)脫環(huán)氧樹脂，切片以NaOH的無水乙醇飽和溶液浸泡30～60min，然后以無水乙醇洗5min，兩次，再以95%，80%，70%酒精各洗5min，然后入水。

（2)經(jīng)餓酸固定過的切片入1%過碘酸10min（0.5μm厚，時間可隨切片厚薄增減)除去餓酸，然后蒸餾水洗5min，4次。

（3)切片用0.05mol/l TBS,pH7.4洗10min。

（4)按石蠟切片第二步往下進行。

三、彩色免疫金銀法（CIGSS)

彩色免疫金銀法（coloured IGSS簡稱CIGSS)是在IGSS基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新方法。其基本原理與彩色顯影相似。IGSS方法染色在抗原位點處生成銀顆粒經(jīng)鐵氰化鉀與溴化鉀的作用即被氧化成溴化銀，后者與彩色顯影劑相接觸立即被還原成金屬銀，而彩色顯影劑本身則被氧化，其氧化產(chǎn)物使彩色成色劑由無色變成有色的染料并沉積在銀顆粒的部位，金屬銀變成了銀離子。由于染料只能通過彩色顯影劑沉積在有銀的部位，所以不與組織發(fā)生非特異性吸附。

以彩色顯影人肝組織內(nèi)HBsAg的操作過程為例：

（1)脫蠟至水。

（2)0.1%胰蛋白酶37^℃10min。

（3)Lugol＇s,碘液5min。

（4)5%硫代硫酸鈉1min。

（5)用0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，兩次。

（6)1%卵白蛋白封閉10min。

（7)馬抗HBsAg抗體1：1000稀釋，37^℃1～2h 或4^℃過夜。

（8)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，兩次。

（9)1%卵白蛋白封閉10min。

（10)PAg 1：40，37^℃45min。

（11)0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，兩次。

（12)雙蒸水洗5min，兩次。

（13)物理顯影（見P116頁物理顯影配方)。

（14)自來水沖洗。

（15)雙蒸水洗5min，兩次。

（16)2%鐵氰化鉀和1%溴化鉀，1min。

（17)雙蒸水沖洗。

（18)彩色顯影（α-萘酚或菲尼酮)2min。

（19)雙蒸水沖洗。

（20)2%鐵氰化鉀和1%溴化鉀，1min。

（21)2%鐵硫代酸鈉和1%亞硫酸鈉，5min。

（22)流水沖洗。

（23)如需要可用蘇木素或核紅復(fù)染。

（24)緩沖甘油封固，觀察。

結(jié)果：CIGSS的優(yōu)點：①陽性結(jié)果比黑色更鮮明;②可以使弱信號得到放大;③消除IGSS背景染色;④信號/背景比值高;⑤是開展免疫金銀雙標(biāo)技術(shù)的新途徑.光鏡下見HBsAg陽性物質(zhì)呈鮮艷的藍色(α-萘酚為成色劑)或呈綠色(菲尼酮為成色劑)。背景干凈，陽性結(jié)果清楚。

四、免疫金及免疫金銀技術(shù)的優(yōu)點

免疫金銀技術(shù)（Immunogold—sliver Technique)是在免疫金基礎(chǔ)上發(fā)展的新興的先進的免疫細胞化學(xué)檢測技術(shù)，它比免疫熒光，免疫酶標(biāo)技術(shù)有許多獨特的優(yōu)點。

1．制備方法簡單，易行。

2．標(biāo)記簡單抗體、凝集素、酶、SPA、激素等很容易通過物理吸附作用與膠體金顆粒相結(jié)合形成穩(wěn)定的金標(biāo)復(fù)合物。由于在標(biāo)記過程中不需要經(jīng)過任何化學(xué)方法交聯(lián)，抗體的生物活性可保持不變，標(biāo)記方法簡單容易。

3．適用范圍廣　膠體金銀技術(shù)既能用于光鏡也能用于透射及掃描電鏡，同時還可用于X線能譜分析。在熒光顯微鏡上添置一塊特制的濾板（IGs filter block)還可直接對膠體金顆粒進行觀察，金顆粒在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)明亮的點狀物，定位準(zhǔn)確，敏感性高，標(biāo)本可長期保存。

4．特異性強免疫金探針的非特異性吸附作用小，較少受生物組織背景因素的影響，在抗原或抗體的檢測中顯示出高度的特異性。

5．敏感性高由于金顆粒的電子密度很大特別適合透射電鏡及掃描電鏡，因此，免疫金銀法用于電鏡，其檢測抗原或抗體率遠遠超過酶反應(yīng)物，從而大大改進了免疫細胞化學(xué)技術(shù)在電鏡水平上的分辨率。光鏡下金顆粒經(jīng)過銀顯影后得到放大，用于檢測組織細胞抗原時其敏感性比PAP法高200倍。我們檢測肝炎表面抗原時比ABC法高6倍，是至今為止最為敏感的免疫細胞化學(xué)方法，特別適合于檢測微量抗原及石蠟切片標(biāo)本中的微弱抗原。

應(yīng)用彩色IGSS和IGSS雙標(biāo)及多標(biāo)記，可在同一張切片上檢測兩種以上的抗原成份。膠體金可以制備成不同大小的顆粒，將不同直徑的膠體金分別標(biāo)記不同的抗體或抗原，可以在同一張標(biāo)本上同時區(qū)分出兩種或兩種以上的抗原或抗體，非常適用于電鏡水平的雙標(biāo)和多標(biāo)記，為研究細胞內(nèi)抗原及多種抗原的表達及各種抗原分子相互之間的關(guān)系等提供了最佳手段。

免疫金銀技術(shù)是新興的科學(xué)技術(shù)，目前許多實驗室越來越廣泛地采用這一新技術(shù)，從而使它的發(fā)展有了扎實的基礎(chǔ)。用免疫熒光、免疫酶技術(shù)、放射免疫技術(shù)可做的工作，均可使用免疫金銀技術(shù)。另外，這一新的方法在其它技術(shù)的配合下不斷地得到更新與進步，使它能經(jīng)常增添新的內(nèi)容，特別是免疫金和膠體金示蹤作為一門獨特的新技術(shù)將在生物醫(yī)學(xué)及其它領(lǐng)域的研究中發(fā)揮著越來越大的作用。

五、在IGSS染色中常見技術(shù)問題和對策

（一)背景染色產(chǎn)生的原因和防止方法

（1)第一抗體或金標(biāo)抗體稀釋度不合適，一般容易犯抗體使用過濃的毛病，認為抗體越濃越好，結(jié)果適得其反。應(yīng)該先作方陣滴定，優(yōu)選最佳稀釋倍數(shù)（見第一章　)，即可避免非特異性染色，又可節(jié)　省抗體。

（2)使用正常箅清封閉和在抗體稀釋液中加入牛血清白蛋白，可以減少非特異吸附，降低背景染色。

（3)顯色的器皿必須徹底清洗，化學(xué)試劑必需用三蒸餾水配制。

（4)乳酸銀和硝酸銀的顯色在避光的環(huán)境中反應(yīng)。醋酸銀則可在有光的環(huán)境中顯色。

（5)顯色時切片應(yīng)垂直放置在銀顯影液中，使過多的銀顆粒下沉，如水平放置易沉淀于切片上。

（6)控制反應(yīng)時間，顯影液加入適量的阿拉伯膠或明膠可以延緩反應(yīng)速度，避免形成過多的還原銀，非特異地吸附在切片上。一般加入明膠1%～2%，效果比較滿意，反應(yīng)時間根據(jù)室溫而定，室溫25^℃左右顯色時間10～15min，室溫在20℃以下，顯色時間20～30min左右。

（7)洗滌：使用TBS時最好加入0.05%～0.1%的Triton X-100或Tween 80，可以洗脫掉組織表面發(fā)生非特異性吸附的污染蛋白，防止出現(xiàn)背景的非特異染色。

（二)背景染色已發(fā)生應(yīng)如何消除

（1)2%硫代硫酸鈉，1%鐵氰化鉀等量混合，加在切片上至背景無色為止。

（2)2%鐵氰化鉀和1%溴化鉀等量混合作用1min水沖洗，然后加上2%硫代硫酸鈉和1%亞硫酸鈉脫色，至背景干凈為止。

（3)0.1%重鉻酸鉀加0.25%濃硫酸，在顯微鏡下控制脫色時間，至陽性結(jié)果清楚，無背景為止。然后用5%硫代硫酸鈉漂白。注意時間不要過長，以免陽性結(jié)果被脫掉。

（4)用0.3%～1%的H₂O₂處理切片也可消除背景的銀顆粒。但必須在顯微鏡下控制脫水時間，防止把陽性結(jié)果脫色。

（三)彩色顯影背景過染的處理方法

彩色免疫金銀法，在膠體金技術(shù)中是一個很大的突破，它的優(yōu)點是結(jié)果鮮明，對比度好，但是在彩色顯影過程中時間過長，背景可有一些著色，彩色顯影的時間控制很重要。一旦過染可用以下方法處理。

（1)純酒精滴到切片上3～5s,立即沖掉，水洗，充分地把酒精洗掉，如果洗不徹底，造成陽性結(jié)果脫色。

（2)75%的酒精滴到切片上1min，立即沖掉，脫色不能時間過長，過長后陽性結(jié)果全部脫掉。

六、物理顯影液及緩沖液的配制

（一)緩沖液的配制

（1)0.05mol/l pH7.4 TBS 配制

Tris（三羥甲基胺基甲烷)12.1g

NaCl 17.5g

加雙蒸水1900ml

然后用濃HCL調(diào)至pH為7.4再加雙蒸水至2000ml

Tris 　4.84g

NaCl 　17.5g

BSA 2.0g

NaN₃1.0g

雙蒸水1900ml,充分攪拌至溶質(zhì)完全溶解,用濃HCl調(diào)pH至8.2,再加雙蒸水至2000ml。

（二)銀顯影液的配制

1．乳酸銀顯影液的配制：混合以下溶液

①10%阿拉伯膠水溶液60ml

②枸櫞酸緩沖液pH 3.5 10ml

③對苯二酚1g,加雙蒸水20ml溶解。

④乳酸銀水溶液100 mg加水10ml。

注意在暗處顯影。

2．硝酸銀顯影液的配制

①10%阿拉伯膠水溶液60ml。枸櫞酸緩沖液ph 3.5 10ml

②對苯二酸1.7g水溶液30ml。

③硝酸銀40mg水溶液2ml。

①②兩溶液完全溶解，臨用前加入硝酸銀溶液。在暗處顯影。

4．彩色顯影液的配制

①0.2N氫氧化鈉的異丙醇溶液5ml溶入100mgα-萘酚（或菲尼酮)。

②500mg碳酸鈉，25mg溴化鉀，50mg亞硫酸鈉，加雙蒸水25ml。

①②兩液1：10混合，室溫下彩色顯影。

5．醋酸銀顯影液

①15%阿拉伯膠60ml，檸檬酸緩沖液10ml，pH3.5。

②對苯二酚1.7g溶于20ml蒸餾水中。

③醋酸銀100mg溶于蒸餾水10ml中。

用前①②③依次混合，不需要避光，在室溫下顯影。

（三)檸檬酸緩沖液的配制

檸檬酸（C₆H₈O₇.H₂O)25.5g

檸檬酸三鈉（Na₃C₆H₅O₇.2H₂O)23.5g

加重蒸水100ml溶解即成，pH3.5

(四)氫氧化鈉（NaOH)無水乙醇飽和溶液的配制

8g氫氧化鈉，加入100ml無水乙醇振搖溶解即成。