實用免疫細胞與核酸:第四節(jié)　非放射性標記的核酸探針

放射性標記核酸探針在使用中的限制，促使非放射性標記核酸探針的研制迅速發(fā)展，在許多方面已代替放射性標記，推動分子雜交技術(shù)的廣泛應(yīng)用。目前已形成兩大類非放射標記核酸技術(shù)，即酶促反應(yīng)標記法和化學修飾標記法。

酶促反應(yīng)標記探針是用缺口平移法，隨機引物法或末端加尾法等把修飾的核苷酸如生物素-11-dUTP摻入到探針DNA中，制成標記探針，敏感度高于化學修飾法，但操作程序復雜，產(chǎn)量低，成本高。

化學修飾法是將不同標記物用化學方法連接到DNA分子上，方法簡單，成本低，適用于大量制備（>50μg)如光敏生物素標記核酸方法，不需昂貴的酶，只在光照10～20min，生物素就結(jié)合在DNA或RNA分子上。

非放射性標記核酸探針方法很多，現(xiàn)介紹常用的幾種方法如下：

一、生物素標記核酸探針方法

生物素標記的核苷酸是最廣泛使用的一種，如生物素-11-dUTP，可用缺口平移或末端加尾標記法。實驗發(fā)現(xiàn)生物素可共價連接在嘧啶環(huán)的5位上，合成TTP或UTP的類似物。在離體條件下，這種生物素化dUTP可作為大腸桿菌多聚酶I（DNA酶I)的底物摻入帶有缺口的DNA或RNA，得到生物素標記的核酸探針。這種標記方法稱為缺口平移法。用標記在DNA上的生物素與鏈霉親合素-酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶)標記物進行檢測。

缺口平移法標記生物素DNA探針：在硅化Eppendorf管（放入冰浴中)加下列反應(yīng)液：

待標記DNA 0.1μg/μl 5μl

10×NTB　1μl

DNase I2pg/μl 1μl

消毒三蒸水 　3μl 總體積達10μl

混勻，37℃，15min。離心10000r/min 1min后，放入冰浴中，繼續(xù)加入下列反應(yīng)液：

dNTP(ACG)0.5μg/ml2μl

Bio –11–dUTP 0.5μg/ml2μl

10×NTb　4μl

消毒三蒸水　31μl

混勻，短暫離心后，加入

DNA聚合酶I（5u/μl)1μl總體積50μl

混勻，14℃過夜（10h以上)，加入

終止液 2μl

經(jīng)Sephadex –G –50柱分離，回收生物素標記DNA。

10×NTB配法：500mmol/l Tris –HCl, Ph7.5；100mol/L MgCl₂；80mmol/L β-巰基乙醇，500μg/ml BSA。

終止液：0.25mol/L EDTA, 10mg/ml tRNA和10mmol/l Tris –HCl (pH7.5)。

缺口平移法標記探針少量多次標記效果較好，即每次標記DNA不超過1μ.Bio –11-dUTP要濃貯，分裝，-20^。C保存，反復凍融常會降解失活。Bwww.med126.comio –11- dUTP貯存液：10mmol/L即100μg Bio-11-dUTP中加入11.6μl Bio-11 –dUTP稀釋液，分裝成3μl/支，-20℃保存。

地高辛-dUTP標記DNA也可按此法進行。

乙醇沉淀分離回收標記DNA比較方便，即加入5μl4mmol/l LiCl,125μl冷乙醇，混勻，-20℃放置30min,12000r/min離心5min，去上清，用70%乙醇和無水乙醇洗沉淀物，倒置離心管，晾干，用消毒三蒸水5μl溶解沉淀物（0.1μg/μl)-20^。C保存。用LiCl 可較好地分離DNA和可溶性核苷酸，因為dNTPS的鋰鹽在乙醇中比鈉鹽溶解性更大。

二、光敏生物素標記核酸探針

光敏生物素有一個連接臂，一端連接生物素，另一端有芳基疊氮化合物。在可見光照射下，芳基疊氮化合物可能變成活化芳基硝基苯，很易與DNA或RNA的腺嘌呤N—7位置特異結(jié)合，大約每50個堿基結(jié)合一個生物素，所以只用于標記大于200個核苷酸的片段。光敏生物素的醋酸鹽很易溶于水，與核酸形成的共價結(jié)合很穩(wěn)定。此法有以下優(yōu)點：方法簡便易行，快速省時，不需昂貴的酶和dUTP等；只需光照，探針穩(wěn)定，-20℃可保存12個月以上。適用于DNA和RNA，抗體和酶等的標記。在原位分子雜交，斑點雜交和Southern印跡雜交中應(yīng)用，其特異性和靈敏性較高，價廉易購，國內(nèi)已有試劑盒供應(yīng)，軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所馬立人教授等研制和生產(chǎn)的光敏生物素核酸探針和檢測試劑盒使用良好。

方法步驟：在一滅菌Eppendorf管中加待標記DNa 5μg/10μl，在暗室中加入5μg/5μl光敏生物素，充分混勻，插入冰浴中，置特制光源下10cm處照射20min。加入100mmol/l Tris –HCl pH9.0, 1.0mmol/L EDTA10μl混勻。再加入等體積仲丁醇，混勻。離心1min（10000r/min)吸去上層仲丁醇，棄去。再加入仲丁醇25μl，重復提取游離的光敏生物素。吸去上層無色仲丁醇后，加入5μl 3mol/L醋酸鈉，充分混勻，加入冷無水酒精100μl充分混勻，沉淀標記DNA，置-20℃過夜（或-70℃15min)15000r/min離心20min，沉淀物再用70%乙醇洗一次，離心，抽干，溶于0.1mmol/l EDTA或TE中，測定探針濃度，分裝，保存于-20℃。

三、生物素-補骨脂素（Biotin -psoralen)標記法

生物素-補骨脂素是另一種生物素光敏物質(zhì)，在長波長紫外線照射下與嘧啶堿基發(fā)生光化學反應(yīng)，加成到DNA中，去除小分子后，得到生物素標記核酸探針。此法可標記單鏈或雙鏈DNA或RNA，及寡核苷酸。靈敏度與放射性探針相當。標記方法：取DNA或片段0.5μg加50μlTE（pH8.0)緩沖液中，再加入5μlg生物素-補骨脂素，溶解后，置365nm紫外光下直接照射20min，距離5cm，加等體積TE，移入用TE平衡的Sephadex G—50 柱（高1.0cm)，離心法過柱，收集液體即為Bio –DNA探針。

四、生物素-α-氨基乙酸-N-羥基琥珀標記化學修飾的DNA法

此法是在亞硫酸鹽催化下，生物素酰肼可置換寡核苷酸探針中胞嘧啶上的氨基，使生物素結(jié)合到DNA分子上而制成生物素化DNA探針。此法優(yōu)點是采用通用試劑和技術(shù)，檢出敏感。Vicied 等人指出DNA和RNA中胞嘧啶N-4位置在亞硫酸氫鹽存在下可用乙二胺連接臂修飾，此過程也可能介導C-6位的磺酸鹽組分。在合適的條件下，可有3%～4%的堿基被修飾。新鮮配制亞硫酸氫鈉-乙二胺混合液，兩者混合液含量分別為1mol/L和3mol/l （pH6.0)，加入對苯二酚，使終濃度為1mg/ml。將DNA用超聲打成500～800bp長度的片段，煮沸法變性，取1份DNA與9份上述混合液混合，42℃水浴3.5h。用5mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH8.5)在40℃下充分透析，濃縮DNA，再溶于200μl 0.1mol/L磷酸鈉緩沖液（pH8.5)，再加入4mmol/L生物素-ε-氨基乙酸-N-羥基琥珀酰亞胺脂，室溫反應(yīng)2h，用含150mmol/l NaCl、1mmol/l EDTA的10mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.0)在40℃下充分透析，純化，-20℃保存。

五、缺口平移法標記生物素DNA探針（二步法)

取HBV質(zhì)粒DNA0.5μg,DNase I(SABC)2pg, 10×NBTμl，三蒸水補足體積至10μl，37℃，15min；加5mmol/l dATP dGTP dCTP Bio –11- dUTP各2μl，10×NBt 4μl，三蒸水補足體積至10μl,37℃，15min；三蒸水補足體積至49μl，DNA聚合酶i 5u，混勻，14℃過夜，加0.5mmol/l ED-TA(Ph8.0)1μl終止反應(yīng)。

已標記探針的提純：10mg/ml tRNA 2μl,10mmol/L Tris –HCl (pH7.5)150μl,2.5倍體積的95%乙醇，置液氮中15min或-20℃過夜。15000r/min，離心10min，真空干燥后，溶于適量三蒸水中，即為純化的探針，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

使用閉環(huán)或線性雙鏈質(zhì)粒DNA，或分離的雙鏈DNA片段均可進行此法標記，全質(zhì)粒標記敏感性較高，因為標記物可同時摻入載體DNA。

此法也可用于放射性同位素和地辛標記DNA法。

六、生物素隨機引物標記探針方法

以HBV DNA為例。取HBv DNA質(zhì)粒0.5μg，隨機引物（Pharmacia)2μg，用TE（pH8.0)補足體積至10μl；100℃，熱變性5min，驟冷10min。加10×緩沖液（500mmol/l Tris –HCl (Ph6.6),100mmol/L MgCl₂,10mmol/L β巰基乙醇)，BSa 500μg/ml 5μl，5mmol/l dATP/dGTP dCTP各1μl，按不同比例加入Bio –11-Dutp,和dTTP，用三蒸水補足體積至48μl，加DNA聚合酶（SABC)8u，混勻，37^℃，2h，加0.5mol/l EDTA(Ph8.0)2μl，終止反應(yīng)。

在隨機引物標記體系中，加入不同梯度濃度比值的Bio-11-dUTP/dTTP(%)，發(fā)現(xiàn)二者比值明顯影響探針標記率和顯色靈敏度。Bio-11-Dutp/dTTP（%)比值為35%時，其標記率最高，顯色靈敏度達0.2pg，雜交靈敏度為1～2pg。二步法缺口平移標記HBv DNA探針，其靈敏度低于隨機引物標記。Mackeg等（Focus,1992；14：21)證實了用隨機引物標記探針具有放大的效應(yīng)。隨機引物中加入一定比例的dTTP，能增加HBv DNA探針的標記率和靈敏度。其靈敏度接近同位素標記探針的靈敏度。

七、異羥基洋地黃毒甙（Digoxigenin)標記核酸探針

1988年德國Boehringer Manheims公司推出了一種地高辛標記DNA檢測試劑盒。先將地高辛甙元通過一手臂聯(lián)接至dUTP上，用隨機引物法標記DNA制成探針。平均每20～25個核苷酸中標記一個地高辛甙元，然后用抗地高辛抗體的Fab片段與堿性磷酸酶的復合物和NBt – BCIP底物顯色檢測，靈敏度達0.1pg DNA，因此可做1μg哺乳動物DNA中單拷貝基因分析。此種探針有高度的靈敏性和特異性，安全穩(wěn)定，操作簡便，可避免內(nèi)源性干擾，是一種很有推廣價值的非放射性標記探針。

標記方法步驟：（1)取一小離心管（0.5ml)插入冰浴中，加入待標記DNa 1μg/5μl，95℃變性10min，迅速移入鹽冰中3min。加入六核苷酸引物2μl，Dig-dNTP標記物2μl和消毒雙蒸水10μl、大腸桿菌DNA聚合酶i Klenow片段1μl(單位)。（2)短時離心，37℃孵育至少60min（20h以內(nèi))。（3)加入2μl 0.2mol/L EDTA溶液中止反應(yīng)。再加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl預冷的乙醇（-20℃)，放入-70^℃至少30min或-20^℃過夜。（4)離心（12000g)10min，棄上清，再加入70%乙醇（冷)40μl洗一次，離心，抽干，再溶于50μl TE溶液（pH8.0)中，分裝，-20℃存放備用。

八、光敏2，4-二硝基苯（光敏DNP)標記DNA法

光敏DNP由一連接臂組成，一端是2，4-二硝基苯，另一端有芳基疊氮化合物。此法適用于含氨基檢測基團。其敏感性和光敏生物素標記探針相同，檢測時需要抗DNP抗體和免疫化學顯色。標記方法：（1)DNA不心變性，必須溶于水中，取2～10μg10μl，加入二甲亞砜25μl，每微克DNA加入光敏DNp 2μg（在避光條件下)，混勻。（2)置入冰浴中，在特制燈10cm下照射10min。（3)加入水165μl，4mol/L醋酸鈉20μl和異丙醇50μl，混勻。（4)用705和無水乙醇沉淀各一次，晾干，按50μg/ml溶于200μl水中，如探針不溶時，可在60℃水溶中加熱10min，離心5min，除去不溶性雜質(zhì)，分裝，-20℃可保存1～2年。此法簡便，不僅適用于核酸標記，也適用于蛋白質(zhì)標記。

九、三硝基苯磺酸（TNBS)標記核酸探針

在溫和的條件下，TNBS將核酸的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為N-甲氧基-5，6-二氫嘧啶-6-磺酸鹽衍生物，對胞嘧啶殘基進行磺化修飾制成磺化半抗原探針。此法十分簡便，也可用于蛋白質(zhì)的標記。標記方法：取變性單鏈的DNA5μg，溶于0.02mol/L硼酸鈉緩沖液（pH8.6)中，加入TNBS5μg溶解，在室溫中反應(yīng)1h。移入冰浴中，加入無水乙醇和70%乙醇各洗1次，晾干，用50μl消毒雙蒸水溶解，分裝，-2jfsoft.net.cn/shouyi/0℃保存?zhèn)溆谩?/p>

十、生物素化的RNA探針標記

RNA探針比cDNA探針的敏感性提高10倍以上，在許多優(yōu)點。它們是單鏈，不需變性，也沒有互補鏈的干擾，與靶基因雜交比DNA探針更穩(wěn)定。Bio-11-dUTP可通過Sp6、T₃和T₇RNA聚合酶摻入到RNA轉(zhuǎn)錄子中。標記方法：其下列反應(yīng)體積為50μl：40mmol/l Tris HCl pH8.0、8mmol/l MgCl₂、2mmol/L亞精胺、25mmol/l NaCl, 1mmol/L每一ATP、GTP、GTP，1mmol/L生物素Bio-11-Dutp,500ng模板，45u T₃RNA聚合酶�；旌�，37℃反應(yīng)1h。加入10%SDS終止反應(yīng)。凝膠過濾分離標記RNA探針。

十一、辣根過氧化物酶標記核酸探針法

此法標記原理如下圖所示：

標記的HRP部分催化底物化學發(fā)光反應(yīng)：氨基苯二甲酰肼

氨基苯二甲酸

+N₂+光→X-光片上感光10～20min顯定影。

光亮子在酚、萘及胺類等增強劑促進下，而使光亮增強。

這種方法就是利用特殊的酶底物，氧化后把產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽芊懦�，稱為化學發(fā)光。雜交后與探針結(jié)合的酶催化相應(yīng)的發(fā)光劑，經(jīng)增強劑將光能放大，在X光片上顯示雜交信號。此方法靈敏度與同位素標記水平相當，簡便快速，安全，是一種特異性好的檢測手段，具有廣泛的應(yīng)用前景。

HBV-DNA的HRP標記方法：質(zhì)粒中插入HBV全基因組DNA，長3.2kb，載體為PBR322質(zhì)粒，4.3kb。將質(zhì)粒DNA用三蒸水稀釋成10ng/μl，取20μl放入EP管，100℃變性5min，加入20u HRP標記試劑，混勻，加入戊二醛20μl混勻，37℃10min，此時可立即使用，或放在冰浴中10～15min內(nèi)使用，或加入50%去離子甘油-20℃保存供分子雜交用，可存放6個月。

十二、用聚合酶鏈反應(yīng)標記高活性DNA探針

聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)或稱體外基因倍增技術(shù)，它利用一對位于待擴增的DNA序列兩端的取向相對的DNA引物，在DNA聚合酶的介導下，經(jīng)過多次變性，退火和延伸過程的重復性循環(huán)，大量合成靶DNA序列。在標記dNTP存在時，經(jīng)PCR反應(yīng)產(chǎn)生的靶DNA片段均參入了標記物，用此法標記的探針標記率高達97.4%。此法重復性好，簡便、快速、特異、不要求模板DNA的純度，可以大量制備。此法有普遍應(yīng)用價值。

標記方法如下：待標DNA模板1ng,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/LMgCl₂dATP、dCTP、dGTP各200μmol/l dTTP150μmol/Ll,Bio-11-dUTP 50μmol./L, 引物各1μmol/L，明膠200μg/ml，2u Taq DAN聚合酶，總反應(yīng)體積為100μl。混勻后，加石蠟油封頂，94℃和55℃各2min，72℃3min，經(jīng)25個循環(huán)后，可產(chǎn)生5～10μg標記探針，需時僅4h。乙醇沉淀擴增的產(chǎn)物后，溶于100μl TE中，分裝-20℃。