| 公開(公告)號(hào) | CN1936012A |
| 公開(公告)日 | 2007.03.28 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200610019800.3 |
| 申請(qǐng)日期 | 2006.08.03 |
| 專利名稱 | 一種抑制N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶V的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建方法及應(yīng)用 |
| 主分類號(hào) | C12N15/79(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12N15/79(2006.01)I;C07H21/04(2006.01)I;C12N1/19(2006.01)I;A61K48/00(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 武漢大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 章曉聯(lián);李冬青 |
| 地址 | 430072湖北省武漢市武昌珞珈山 |
| 頒證日 | |
| 國際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 武漢宇晨專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 王敏鋒 |
| 國省代碼 | 湖北;42 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種抑制N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶V的shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征是包括下列步驟： A.根據(jù)Genebank提供的MGAT5的基因序列，從編碼區(qū)中選取第836-856位核苷酸序列TCGGGCTTCAAGATTGCGG為靶序列，設(shè)計(jì)并合成引物，引物為： siRNA1-Oligo1：5’-TCGGGCTTCAAGATTGCGGTTCA-3’ siRNA1-Oligo2：5’-AGCTTGAACCGCAATCTTGAAGCCCGAGGCC-3’ siRNA1-Oligo3：5’-AGCTTCCGCAATCTTGAAGCCCGATTTTTT-3’ siRNA1-Oligo4：5’-AATTAAAAAATCGGGCTTCAAGATTGCGGA-3’ siRNA2-Oligo1：5’-AAGATTGAGCCGTATATGCCATTCA-3’ siRNA2-Oligo2：5’-AGCTTGAATGGCATATACGGCTCAATCTTGGCC-3’ siRNA2-Oligo3：5’-AGCTTTGGCATATACGGCTCAATCTTTTTT-3’ siRNA2-Oligo4：5’-AATTAAAAAAGATTGAGCCGTATATGCCAA-3’ B.將載體psilencer1.0-U6經(jīng)ApaI、HindIII雙酶切，用回收試劑盒回收； C.siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火，用雙蒸水稀釋引物至20pmol/μl，取siRNA1-up與siRNA1-down各2μl，加水補(bǔ)至20μl，95℃ 2～8分鐘，55℃ 10～20分鐘，冷卻至室溫，siRNA2-Oligo1與siRNA2-Oligo2退火方式與本步驟相同； D.取1μl siRNA1-Oligo1與siRNA1-Oligo2退火退火產(chǎn)物，加入1μlpsilencer1.0-U6經(jīng)ApaI、EcoRI雙酶切回收后的產(chǎn)物，1μl T4連接酶和2μl 10×連接緩沖液，加雙蒸水補(bǔ)至20μl體系，置于4℃反應(yīng)過夜，siRNA2-Oligo1與siRNA2-Oligo2退火產(chǎn)物的連接方法與本步驟相同； E.將步驟D所得的連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，取連接產(chǎn)物10μl，加入100μl DH5α感受肽細(xì)胞，冰浴30分鐘，42℃ 90秒，再冰浴5分鐘，加入800μl LB液體培養(yǎng)基，37℃，225rpm振搖40～50分鐘，取200μl菌液均勻涂在有氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜； F.挑取單個(gè)克隆菌落，置于3ml LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜； G.提取步驟F獲得的菌液的質(zhì)粒DNA； H.所提質(zhì)粒DNA經(jīng)ApaI、HindIII酶切鑒定，選出正確質(zhì)粒，此質(zhì)粒再經(jīng)ApaI、EcoRI雙酶切、回收，按步驟D的方法與siRNA1-Oligo3與siRNA1-Oligo4退火退火產(chǎn)物連接； I.將步驟H所得的連接產(chǎn)物按步驟E的方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α； J.挑取單個(gè)克隆菌落，置于3ml LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取菌液的質(zhì)粒DNA； K.所提質(zhì)粒DNA經(jīng)ApaI、HindIII、EcoRI酶切鑒定，選出質(zhì)粒，為shRNA1-Mgat5。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種抑制N-乙酰葡萄糖胺轉(zhuǎn)移酶V的shRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法及應(yīng)用，其步驟是根據(jù)Genebank提供的MGAT5的基因序列，選取編碼區(qū)第836-856位核苷酸序列TCGGGCTTCAAGATTGCGG為靶序列設(shè)計(jì)并合成引物，通過引物退火，連接至載體psilencer1.0-U6，得到真核表達(dá)載體shRNA1-Mgat5，將shRNA1-Mgat5轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞MA782，能明顯抑制MA782細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長，該質(zhì)粒在制備治療或預(yù)防乳腺癌的藥物中的應(yīng)用，前景廣泛。 |
| 國際公布 |
