 |
 |
1.2.2 MTT法 肝癌HepG2細(xì)胞用0.25%胰酶處理制成單細(xì)胞懸液，以每孔約104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板（每孔100 μL)。分別加入不同濃度的苦參堿溶液，使其終濃度為0.5、1.0、2.0 mg/mL，每個(gè)濃度設(shè)三個(gè)孔。然后在加培養(yǎng)液100 μL，每孔總體積為200 μL，同時(shí)設(shè)定空白孔及對(duì)照孔。然后放回CO2箱中培養(yǎng)24、36、48 h。分別在各個(gè)時(shí)間段結(jié)束前4 h加入MTT（5 mg/mL)溶液10 μL，反應(yīng)4 h離心棄上清液。每孔加入DMSO 150 μL振蕩蕩5～10 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm 的吸光值。根據(jù)公式計(jì)算：腫瘤細(xì)胞增值抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。
1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 肝癌HepG2細(xì)胞以5×104/mL接種至6孔板中，細(xì)胞貼壁后，分別加入0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL的苦參堿，培養(yǎng)36 h后，收集細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀行細(xì)胞周期分析。
1.2.4 單磺酰戊二胺（ monodansylcadaverine， MDC)熒光染色 將DMEM液培養(yǎng)的肝癌HepG2細(xì)胞以1×104/mL接種至12孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入0.5、1.0、2.0 mg/mL的苦參堿，培養(yǎng)36 h棄培養(yǎng)液，用PBS液洗2遍，加入50 μmol/L MDC，37℃孵育10 min染色。再用PBS漂洗細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下觀察。
1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)（α)為0.05。多組間計(jì)量資料采用單因素方差分析檢驗(yàn)；兩組間計(jì)量資料采用t 檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 苦參堿顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖
MTT測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1，苦參堿顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)時(shí)間-劑量依賴(lài)性。見(jiàn)表1�？鄥A0.5、1.0、2.0mg/mL 作用于肝癌HepG2細(xì)胞36 h后的抑制率分別：（17.21±2.02)%、（28.25±3.20)%、（38.77±5.58)%。
2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果
不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞36 h后，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期見(jiàn)表2。結(jié)果所示：不同濃度苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞中36 h后，G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。結(jié)果表明苦參堿將肝癌HepG2細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的G1期。
2.3 MDC染色顯示苦參堿誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞自噬的產(chǎn)生 醫(yī).學(xué)全.在.線(xiàn)網(wǎng)站jfsoft.net.cn
為了研究苦參堿是否誘導(dǎo)了肝癌HepG2細(xì)胞自噬的產(chǎn)生，本文用熒光鏡觀察MDC染色的肝癌HepG2細(xì)胞，細(xì)胞顯著的形態(tài)學(xué)變化如圖2所示。MDC是自噬泡的特異性標(biāo)記物熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)到清晰的點(diǎn)泡狀結(jié)構(gòu)，表明苦參堿誘導(dǎo)了自噬 的產(chǎn)生。
A～C：分別為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL濃度的苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞后，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)到大量MDC標(biāo)記的自噬顆粒。箭頭所指為MDC標(biāo)記的自噬泡 3 討論
原發(fā)性肝癌是惡性程度最高的腫瘤之一。全球男性發(fā)病率位于惡性腫瘤的第5位，死亡率居惡性腫瘤的第2位；全球女性發(fā)病率位于第7位，死亡率位 于第6位。全球每年新發(fā)肝癌約75萬(wàn)人，而我國(guó)占半數(shù)以上[6]。由于肝癌具有惡性程度高、病情發(fā)展快、預(yù)后差、死亡率高等特點(diǎn)，多數(shù)就診時(shí)已屬晚期。目 前手術(shù)治療依然是肝癌的首選，但是肝癌發(fā)病隱匿， 確診時(shí)能手術(shù)者僅占l0%～15%，因此必須聯(lián)合其他非手術(shù)措施（如化療、生物治療等)進(jìn)行綜合治療，才能有望提高肝癌患者的長(zhǎng)期生存率[7]。近年來(lái)， 苦參堿作為一種新型化療藥物，具有療效顯著、副作用小、毒性低等特點(diǎn)應(yīng)用于臨床。
苦參堿（Matrine)是中藥苦參、山豆根、苦豆子的主要活性成分，具有保護(hù)肝細(xì)胞、抗病毒、抗過(guò)敏等多種藥理作用[8]。此外苦參堿具有 廣泛的抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)：在體外實(shí)驗(yàn)中苦參堿可明顯地誘導(dǎo)人乳腺癌[9]、骨肉瘤[10]及肝癌細(xì)胞[11]等的凋亡�？鄥A的抗腫瘤的作用機(jī)制很 多，主要包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以及細(xì)胞毒等多種作用[3，12-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：苦參堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞 有明顯的抑制作用，不同濃度的苦參堿作用不同時(shí)間后，肝癌細(xì)胞的存活率降低，這種抑制作用呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期結(jié)果：苦參堿作用于 人肝癌HepG2細(xì)胞后， G1 期細(xì)胞數(shù)目明顯增多，S期細(xì)胞數(shù)目減少（P < 0.05)，這表明苦參堿作用肝癌細(xì)胞后將細(xì)胞周期阻滯在G1期，使細(xì)胞不能進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，并最終抑制了肝癌HepG2細(xì)胞的抑制，本文實(shí)驗(yàn)結(jié) 果與以往郭丹等[14]、夏寶妹等[15]、楊道科等[16]在肝癌、子宮內(nèi)膜癌以及結(jié)腸癌細(xì)胞中的研究結(jié)果一致。同時(shí)熒光顯微鏡檢測(cè)：苦參堿誘導(dǎo)肝癌 HepG2細(xì)胞自噬泡的產(chǎn)生，這表明自噬參與了苦參堿抑制肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，可能提示苦參堿作用于肝癌HepG2細(xì)胞后，自噬多發(fā)生在細(xì)胞周期的 G1期。而自噬作為一把雙刃劍，它與腫瘤之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，既可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，也可以誘導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)，在本實(shí)驗(yàn)研究中認(rèn)為它參與了苦參堿抑制肝癌細(xì) 胞的增殖。本文在既往研究的基礎(chǔ)上，探討了苦參堿對(duì)人肝癌HepG2增殖及其細(xì)胞自噬的影響，而其發(fā)生的信號(hào)通路及其作用機(jī)制仍需作進(jìn)一步的研究。希望本 實(shí)驗(yàn)研究能為細(xì)胞周期與腫瘤的增值、分化等之間的關(guān)系提供研究基礎(chǔ)，為臨床進(jìn)一步更好的治療肝癌提供理論基礎(chǔ)。
