中國(guó)幽門(mén)螺桿菌研究:聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)胃粘膜中的幽門(mén)螺桿菌

已經(jīng)證實(shí)幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp)是引起慢性B型胃炎的主要原因，在十二指腸潰瘍病的發(fā)病機(jī)理中起重要作用，與胃癌的關(guān)系也越來(lái)越受到學(xué)者們的重視。診斷Hp感染的方法已有很多，其缺點(diǎn)是不夠敏感，因此，需要一種快速、可靠，具有高度敏感性的檢測(cè)方法。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR)用于檢測(cè)Hp感染國(guó)外已有報(bào)道，國(guó)內(nèi)也有人用此方法檢測(cè)唾液中的Hp。本文報(bào)道了用PCR技術(shù)從胃粘膜活組織中檢測(cè)Hp，并探討該方法在Hp感染的診斷和在評(píng)價(jià)治療后根除效果中的意義。

1　材料和方法

1.1　PCR方法的建立

1.1.1　細(xì)菌菌株和培養(yǎng)

Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637.NCTC11848及空腸彎曲桿菌NCTC11351來(lái)自倫敦國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心（National Collectionof Type Culture)，由本院傳染科保存并提供。50株Hp臨床菌株來(lái)自因胃腸癥狀在本院行胃鏡檢查的病人，取胃竇活組織標(biāo)本一塊，勻漿后接種于含萬(wàn)古毒素10μg/ml，兩性毒素B2μg/ml甲氧芐淀（TMP)5μg/ml的7％羊血瓊脂培養(yǎng)基，于37℃微需氧條件培養(yǎng)3d～7d。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色，以及尿素酶、過(guò)氧化氫酶、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性進(jìn)行細(xì)菌鑒定。金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、不動(dòng)桿菌、克雷白肺炎桿菌、傷寒桿菌、陰溝桿菌、弗氏痢疾桿菌及胎兒彎曲桿菌由本院臨床藥理研究所提供。

1.1.2　細(xì)菌DNA的提取

Hp菌種轉(zhuǎn)種于含7％羊血的瓊脂培養(yǎng)基，37℃微氧條件培養(yǎng)3d，非Hp菌種按常規(guī)方法轉(zhuǎn)種培養(yǎng)24～48h后收獲。以氯化芐方法提取細(xì)菌DNA，所用試劑按文獻(xiàn)相應(yīng)減少。于分光光度計(jì)上測(cè)定HpNCTC 11637　DNA 的OD260及OD280，計(jì)算DNA濃度。

1.1.3　引物的選擇

CP1/P2引物來(lái)自Hp16SrRNA基因，參考Hoshiua等提供的序列，由中國(guó)科學(xué)院遺傳所合成并純化。CP1：5"—GCGCAATCAGCGTCAGGTAATG—3"CP2：5"—GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC—3"，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度500bp。

1.1.4　PCR擴(kuò)增Hp16SrRNA片段

采用50μl，擴(kuò)增體系：10mmol/Ltris·HCI（Ph8.3)；50mmol/LKCL；1.5MMOL/LgCI2；0.01％明膠；各200umol/LdATP、dcTP、dTTp、dGTP（Boehringer公司產(chǎn)品)；各0.5μmcpl。CP2引物；1.www.med126.com25UTaqDNA聚合酶（中國(guó)科學(xué)院遺傳所產(chǎn)品)；1μl模板DNA。拉增反應(yīng)在Perkin－Elmer公司的DNa Thermal Cycler480上進(jìn)行：96℃5min，1個(gè)循環(huán)；94℃1min變性，55℃1min退火，72℃1.5min延伸，35個(gè)循環(huán)；最后于72℃繼續(xù)延伸10min。反應(yīng)中以HpNCTC11637做陽(yáng)性對(duì)照，以去離子水代替模板DNA做陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2　PCR檢測(cè)胃粘膜活組織標(biāo)本中的Hp

96名因上胃腸癥狀行胃鏡檢查的病人及25名因Hp感染經(jīng)抗生素根除治療后復(fù)查胃鏡的病人，于胃竇部取粘膜活組織，分別做尿素酶試驗(yàn)（蘭州軍醫(yī)學(xué)校生產(chǎn)試劑盒)，細(xì)菌培養(yǎng)及Warthin－Starry銀染檢查（由本科專(zhuān)職病理醫(yī)師完成)。另取胃竇粘膜活組織村本一塊，置500μlTE（10mmol/LTris.HCI.1mmol/LEDTA)（pH8.0)緩沖液中研碎，加10％SD30μl蛋白酶K（20mg/ml)3ml，55℃消化1h，以等體積苯酚—氯仿提取模板DNA用于PCR檢測(cè)，標(biāo)本處理程中以緩沖液做陰性對(duì)照。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用配對(duì)四格表資料的X²檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1　PCR方法的敏感性

采用10倍系列稀釋的HpNCTC 11637DNA檢測(cè)PCR反應(yīng)的敏感性。1μg～0.1pg的DNA擴(kuò)增后在1％瓊脂糖凝膠上均產(chǎn)生可見(jiàn)的條帶，檢出的最低Hp DNA量為0.1pg，相當(dāng)于100個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。

2.2　PCR的特異性

引物CP1/CP2對(duì)Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC 11637、NCTC11848及50株臨床分離的Hp菌株擴(kuò)增后均可產(chǎn)生500bp預(yù)期片段，而對(duì)13株非Hp菌株，包括金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、不動(dòng)桿菌、克雷白肺炎桿菌、傷寒桿菌、陰溝桿菌、弗氏痢疾桿菌、胎兒變曲桿菌及空腸變曲桿菌NCTC11351均呈陰性反應(yīng)；對(duì)無(wú)Hp感染的人胃粘膜也呈陰性反應(yīng)。

2.3　PCR與常規(guī)檢測(cè)方法的比較

①PCR對(duì)初診病人Hp感染的診斷：用PCR方示檢測(cè)了96名因上胃腸癥狀前次行胃鏡和胃粘膜活組織檢查的病人，并與尿素酶試驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)和Warthin－Starry銀染色等常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行了比較（表1，2)。在四項(xiàng)檢查方法中，PCR檢出的陽(yáng)性病人數(shù)最多，與尿素酶試驗(yàn)和細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果比較有顯著性差異（P＜0.05)。PCR方法還檢出2例上述三項(xiàng)常規(guī)檢方法均為陰性的Hp感染者。所有細(xì)菌培養(yǎng)或銀染色陽(yáng)性的病人，用PCR檢測(cè)均呈陽(yáng)性。②PCR對(duì)藥的物治療后Hp是否根除的評(píng)價(jià)：用PCR方法檢測(cè)了25名十二指腸潰瘍病伴Hp感染經(jīng)不同抗生素方案治療的病人，并與尿素酶試驗(yàn)，細(xì)菌培養(yǎng)及銀染色方法比較（表3)。發(fā)現(xiàn)其中20名病人常規(guī)三項(xiàng)檢測(cè)方法均為陰性，認(rèn)為Hp已被根除，然而用PCR方法檢測(cè)卻發(fā)現(xiàn)在這20名所謂Hp已被根除的病人中有4例Hp仍為陽(yáng)性，從而表明藥物治療并未使這4名病人感染的Hp徹底根除。對(duì)這4名病人中的3名于停藥后5月～6月復(fù)查，發(fā)現(xiàn)2名病人尿素酶試驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)及銀染色均轉(zhuǎn)為陽(yáng)性。證明PCR能檢出治療后用常規(guī)方法治能檢出、而實(shí)際上仍然存在的少量Hp。

表1　胃粘膜活組織4種方法檢測(cè)Hpjfsoft.net.cn的結(jié)果

表2 PCR與常規(guī)方法陽(yáng)性檢出率的比較

^aP＜0.05，νsPCR

表3　十二指腸潰瘍伴Hp感染治療后檢測(cè)結(jié)果

3　討論

自從1983年Warren和Marshall報(bào)道從人胃粘膜中成功地分離出Hp以后，不少學(xué)者致力于Hp診斷的研究，旨在建立一種快速、簡(jiǎn)便，具有高度敏感性和特異性的診斷方法。當(dāng)前，臨床上應(yīng)用最廣泛的仍是通過(guò)胃鏡取胃粘膜活組織做尿素酶試驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)及組織學(xué)染色（Warthin－Starry銀染色)后做顯微鏡檢查。尿素酶試驗(yàn)快速、簡(jiǎn)便，但常有假陽(yáng)性和假陰性。細(xì)菌培養(yǎng)則要盡可能縮短接種前標(biāo)本的轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢且需要特殊的培養(yǎng)條件，球形Hp則不易培養(yǎng)成活。銀染色后做顯微鏡檢查雖然敏感性和特異性均高，但操作較煩瑣，要求技術(shù)熟練程度高，且費(fèi)時(shí)，價(jià)格較貴。非侵入性的方法如¹³C或¹⁴C呼氣試驗(yàn)雖具有快速、可靠、無(wú)痛苦的優(yōu)點(diǎn)，但費(fèi)用較高，且接觸同位素。血清抗體的檢測(cè)則主要用于流行病學(xué)研究。作者的PCR方法與上述傳統(tǒng)檢測(cè)方法比較，不僅快速、簡(jiǎn)便，而且證實(shí)引物CP1/CP2對(duì)Hp的擴(kuò)增是特異的，而對(duì)其它細(xì)菌和無(wú)Hp感染的人胃粘膜則無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)。該方法只需從胃粘膜活檢標(biāo)本中粗提模板DNA，其檢出的最小Hp DNA量為0.1pg，相當(dāng)于100個(gè)細(xì)菌細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似。

本研究中將PCR技要用于Hp感染的診斷，并與傳統(tǒng)的尿素酶試驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)及銀染色方法進(jìn)行了比較，9例細(xì)菌培養(yǎng)陰性及2例銀染色陰性者，用PCR檢測(cè)則全部為陽(yáng)性。PCR與尿素酶試驗(yàn)及細(xì)菌培養(yǎng)的結(jié)果比較有顯著性差異，而與銀染色比較差異尚無(wú)顯著性，可能由于受檢樣本數(shù)不夠。以上結(jié)果表明，PCR技術(shù)確實(shí)較常規(guī)檢測(cè)方法更為敏感，可以檢出常規(guī)方法不能檢出的Hp，是Hp感染的最敏感的方法。這與國(guó)外文獻(xiàn)的結(jié)論一致。

本研究中將PCR技術(shù)用于抗生素治療后檢測(cè)Hp是否被根除，發(fā)現(xiàn)20例3項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)方法均為陰性認(rèn)為Hp已被根除的患者，用PCR方法檢測(cè)證實(shí)其中4例Hp仍為陽(yáng)性。說(shuō)明藥物治療并未使這4名病人感染的Hp徹底根除，只是細(xì)菌數(shù)量減少，用常規(guī)檢查方法難以檢出。對(duì)其中3名治療后僅PCR呈陽(yáng)性的病人的隨訪(fǎng)中證實(shí)，2名病人于停藥后5個(gè)月和6個(gè)月時(shí)尿素酶試驗(yàn)、細(xì)菌培養(yǎng)及銀染色均轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，表明PCR用于評(píng)價(jià)藥物治療后Hp是否被根除，可以及早發(fā)現(xiàn)治療不徹底，且在短期內(nèi)感染可能復(fù)發(fā)的患者，從而指導(dǎo)繼續(xù)藥物治療，防止同一株Hp感染的復(fù)發(fā)。