中國幽門螺桿菌研究:幽門螺桿菌全菌抗原與尿素酶抗原ELISA血清學(xué)檢測的應(yīng)用

大量研究資料證明，幽門螺桿菌（H.pylorjfsoft.net.cn/kuaiji/i，Hp)是人類慢性胃炎和消化性潰瘍的重要致病菌且與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。它可通過胃粘膜活檢組織尿素酶試驗和Hp培養(yǎng)來診斷其感染，但病人必須接受胃鏡檢查，由于檢查時痛苦較大，更不易被復(fù)查和隨訪患者接受。Hp的尿素酶抗原可刺激機產(chǎn)生高滴度的循環(huán)抗體，其中IgG抗體滴度在未經(jīng)系統(tǒng)抗Hp治療的人群中，能確切地反映人體內(nèi)目前有無Hp感染，在感染病人經(jīng)抗Hp治療殺滅了體內(nèi)Hp3～6個月后，IgG抗體滴度能下降25％～50％，因此可客觀地反映治療效果。

1　材料和方法

1.1　血液標(biāo)本

血液標(biāo)本676例患者，平均年齡43.5歲（18歲～87歲)，主要癥狀為上腹痛及（或)食后上腹脹、惡心或嘔吐、燒灼感染、反酸、噯氣、食欲不振。少數(shù)病例經(jīng)胃鏡檢查，結(jié)果正常胃炎等器質(zhì)性病變。采取肘靜脈血2ml進行檢測。

1.2　Hp尿素酶純化抗原的制備

①菌株選擇及細菌培養(yǎng)：實驗選擇尿素酶活性高的Hp菌，接種含6％脫纖維羊血的布氏平皿中，置混合氣體（5％O₂、10％CO₂和85％N₂)環(huán)境中，37℃培養(yǎng)3d后收菌。②細菌破碎及預(yù)處理：將收集之Hp菌用生理鹽水洗2遍后，用凝膠過濾洗脫液將菌稀釋至15億菌/ml，用超聲波在冰浴中進行破碎后，經(jīng)高速離心12000r/min，30min后取上清備用。③凝膠過濾用SephadesG200柱進行，洗脫液測定尿素酶活性并將其活性峰與相應(yīng)菌全菌蛋白，上柱液及離心沉渣進行SDS－PAGE分析，觀察尿素酶提純效果，Western blot分析是將尿素酶活性峰，經(jīng)SDS－PAGE將各蛋白分離后，經(jīng)電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，處理、染色照相，并記錄結(jié)果。

1.3　血清抗Hp尿素酶抗體的檢測

血清抗Hp尿素酶抗體的檢測：采用ELISA（按照Kesumen法改良)，檢測對象為門診受診的各類胃病患者共676例，經(jīng)純化尿素酶抗原包被的40孔（或96孔)酶標(biāo)板，用0.5％明膠0.1ml37℃作30min封閉，用洗滌液洗板三次，加入待檢血清并以特異性抗HpU抗體的含量為66μg/ml標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為判斷村準(zhǔn)。加二抗HRP　SPA，用PBST20稀釋后，每孔加入0.1ml，37℃孵育30min，洗板3次后，在避光條件下與底物液中加入適量30％過氧化氫及鄰苯二胺，溶解后，每孔加入0.1ml，37℃孵育，顯色5min～10min，加2mol/LH₂SO₄終止液每孔0.1ml，用49nm波長測吸光度（A)[舊稱光密度（OD)，下同]（或目測)。目測觀察：顏色淺于或等于標(biāo)準(zhǔn)陽性對照者為陽性，顏色深于標(biāo)準(zhǔn)陽性對照者為陰性。儀器測定：以酶標(biāo)儀測定各孔吸光度（A)大于或等于標(biāo)準(zhǔn)陽性對照者為陽性，吸光度（A)小于標(biāo)準(zhǔn)陽性對照者為陰性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)性對照吸光度（A)大于或等于0.2時，若陰性對照吸光度（A)小于0.1則試劑盒有效。ELISA特異性經(jīng)吸收試驗鑒定，確定與空腸變曲菌（C.jejuni)、結(jié)腸變曲菌（C.coli)及海鷗變曲菌（C.laris)無交叉反應(yīng)。

2　結(jié)果

2.1　HpU抗原純化

應(yīng)用SephadesG200柱，從Hp超聲破碎物離心上清液中，一次性提純了Hp尿素酶抗原。SDS—PAGE分析結(jié)果表明，所提取的Hp尿素酶抗原中僅含有66KD及30KD兩種蛋白成分，與Hp尿素酶蛋白兩種亞基的大小完全相同，提取物中幾乎不含有其他雜蛋白成分，經(jīng)Western blot分析，證明所提純的Hp尿素酶抗原仍具有良好的抗原性。

為了檢測HpU純化抗原的敏感性與特異性，實驗選擇經(jīng)Hp全菌蛋白抗原對人血清特異性抗Hp－IgG抗體檢測的陽性及陰性各類胃病（慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎等)患者血清各50份進行對比研究，結(jié)果用混合多型HpU純化抗原比全菌蛋白抗原為敏感，且特異性高（表1)。

表1　Hp全菌抗原與尿素酶純化抗原ELISA法檢測比較

X²＝6.38，P＞0.025

2.2　人血清特異性抗HpUIgG抗體的測定：用目測和酶標(biāo)儀測定胃病患者人群中血清抗HpUIgG抗體。按表2分析，以特異抗HpU抗體的含量為66μm/ml標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，ELISA法與免疫印跡分析對照，敏感性為98％，特異性為96％。

表2　676份病人血清抗幽門螺桿菌尿素酶抗體ELISA檢測結(jié)果

3　討論

Hp是人胃內(nèi)唯一產(chǎn)生高活性尿素酶的細菌，可通過檢測胃內(nèi)尿素酶的活性來診斷Hp感染，現(xiàn)已發(fā)展了多種檢測方法，如14N尿素酶排泄試驗。¹³C或¹⁴C_—呼吸試驗，均有較高的敏感性和特異性，但是以上幾種方法均需要特殊的檢驗設(shè)備和技術(shù)，不易在基層推廣和應(yīng)用，因此血清中Hp特異性抗體的檢測，在檢出與Hp相關(guān)性胃炎的診斷中尤為重要，與侵入性診斷方法或呼吸試驗相比，血清學(xué)診斷易為患者接受，而ELISA法則更為常用，若用患者自身菌株作抗原較用標(biāo)準(zhǔn)菌株作抗原在ELISA試驗中更能觀察到明顯的IgG滴度。

目前應(yīng)用于ILISA抗原有三類：①全細胞jfsoft.net.cn/zhuyuan/抗原和超聲粉碎物抗原；②部分純化抗原；③高度純化抗原。Hp全菌細胞和未純化的細胞超聲波粉碎物抗原，用于Hp感染的血清學(xué)診斷一般特異性不高。用Hp多種抗原制品的混合物純化的純化尿素酶組分抗原，則可獲較高的特異性與敏感性。

實驗采用ELISA法對676份人血清進行了抗HpU抗體的檢測，以特異性抗HpU抗體的含量為66μg/ml標(biāo)準(zhǔn)陽性血作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，其敏感性及特異性各為98％及96％。

對于Hp陽性的慢性胃炎，抗菌治療是一種新的治療方法，我們已往研究表明慢性胃炎，尤其是活動性胃炎與Hp感染更是密切相關(guān)，在抗菌治療前后用ELISA法檢測血清Hp抗體，抗菌治療后抗體滴度明顯下降，與Hp清除有關(guān)，炎癥程度減輕（活動性胃炎癥消失)具有相關(guān)性。非潰瘍性消化不良（NUD)是常見的臨床癥候群，目前對其病因認(rèn)識尚不清楚，一般認(rèn)為是多樣性（heterogeneous)，其中慢性胃炎占很大比例，而與Hp感染密切相關(guān)，經(jīng)胃鏡胃粘膜活檢有半數(shù)以上有Hp存在，故認(rèn)為Hp在NUD病人中有一定致病作用。人群血清抗HpU抗體ILISA法檢查，屬于創(chuàng)傷檢測，可用作初篩檢查，以后隨訪，可免去病人多次胃鏡檢查之苦，節(jié)省不必要的檢查費用，減少交叉感染機會，有較好的依從性（compliance)和可靠性�？傊�，用血清抗HpU抗體ELISA法檢測，對于慢性胃炎及非潰瘍性消化不良中Hp抗體的檢出，抗菌治療方案的確定，抗菌治療方案的隨訪與評價及流行病學(xué)調(diào)查研究，是一項簡便、可靠、實用的方法。