在腎臟疾病時，免疫細胞化學技術主要應用于腎臟穿刺組織的檢查，也可應用于血清或腎臟洗脫液及尿液的特殊檢查，茲分述如下：
腎穿刺組織一般應切割為三小塊，分別作冰凍切片、石蠟切片及超薄切片，進行熒光顯微鏡、光學顯微鏡及透射電鏡觀察。所應用的免疫細胞化學技術包括免疫熒光、免疫酶標及免疫電鏡，茲分述如下：
（一)免疫熒光細胞化學技術的應用
自1938年超高壓汞燈熒光顯微鏡問世后，Coon于1942年首先應用熒光素標記抗體檢查肺炎球菌，為熒光抗體技術的發(fā)展奠定了基礎。1961年Dixon開始在腎臟疾病中應用，對腎臟的免疫病理研究起了重要的推動應用，并逐漸成為在腎臟疾病的病理診斷中不可缺少的重要環(huán)節(jié) 。主要用于冰凍切片，具體操作技術如下：
1．切片及染色腎組織要求為未經任何處理的新鮮組織，應立即送入恒溫冷凍切片機（cryostat)內，將腎組織放置于金屬托上，周圍添加OCt compound 包埋劑（如無包埋劑，滴加數滴生理鹽水亦可)，迅速冷凍至-20℃，切出3~5μm厚的冰凍切片附貼于載玻片上，至少需切10張以上備用。繼而使用熒光素標記之各種抗體進行免疫熒光染色（具體操作步驟參見第三章 )。所使用之熒光標記抗體包括羊或兔抗人各種免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)、抗人補體各種成分（C1q、C4、C2、C3、C5、備用素、B因子等)以及抗人纖維蛋白元等，以期了解腎小球內有何種免疫球蛋白沉積、補體激活的途徑和有無凝血機制啟動。此外，目前尚有應用熒光標記之抗纖維連接蛋白（fibronectin)、抗層粘連蛋白（laminin)、抗α-纖溶酶抑制因子（α-PI)、抗纖溶酶原（P1q)等特殊抗體，以探討研究各種腎小球腎炎時腎小球內纖維連接蛋白和層粘連蛋白分布情況的變化以及凝血和纖溶系統(tǒng)成分的變化。常使用之熒光素為異硫氰酸熒光素（FITC，顯綠色熒光)及異硫氰四乙基羅達明（Rodamine B-200，顯橙紅色熒光)，對各種抗體進行標記。必須指出，每種熒光抗體只能檢測一種相應抗原，因此必須準備多張冰凍切片，才能滿足檢查要求。一般在檢查每一種抗原時，只能使一種相應抗體用熒光顯微鏡進行觀察。如果同時需要檢查二種抗原時，可同時使用FITC及RB-200標記的不同抗體進行雙標記法觀察。
2．熒光顯微鏡觀察一般要求使用質量較高的熒光顯微鏡，最好使用落射光型，以提高在高倍鏡觀察時之清晰度，并應配備電子攝影裝置，以便及時進行記錄。進行熒光顯微鏡觀察時，濾光片之配合使用十分重要。以常用之日本olympus熒光顯微鏡為例，觀察FITC標記之抗體時，激發(fā)濾光片須使用RG-12，而壓制濾光片應使用O-350，如觀察RB-200標記之抗體時，激發(fā)濾光片須使用UG-1，而壓制濾光片應使用R-610。觀察時應做以下記錄：①使用抗體的種類。②熒光顯示的部位：如顯示于腎小球毛細血管壁、系膜區(qū)、腎球囊壁、腎小管基底膜、間質血管壁及間質細胞等。③熒光顯示的型式、：為連續(xù)線形、不連續(xù)顆粒狀、團塊狀或短線狀，不規(guī)則狀等。④熒光顯示的強度：可分為（—)熒光弱、（±)為熒光微弱、（+)為明確可見熒光、（++)為明亮熒光、（+++)為耀眼熒光。在特殊情況下可進行雙重標記，即分別使用FITC標記和RB-200標記的兩種不同抗體，在同一切片上進行染色，使用不同濾光片進行觀察及攝影，以綠色熒光和橙紅色熒光在同一張切片上顯示兩種抗原分布的部位。
3．熒光顯微鏡攝影技術使用熒光顯微鏡觀察時，由于光源紫外線的照射，切片標本上抗原的熒光亮度常很快逐漸減弱，并可發(fā)生熒光淬滅現象；且免疫熒光染色的切片不能長期保存，因此必須立即及時進行顯微攝影以記錄所觀察到的情況，以作為診斷根據和作為資料保存。攝影時一般應使用感光速度較快的彩色膠片，以160或400ASA為宜，才能保證拍攝出良好的熒光圖像。必須指出的是，在標本的熒光強度不太明亮時，使用自動曝光攝影設備常不能取得良好的攝影效果。由于在攝影過程中，熒光強度逐漸減弱，照像機快門常長期不能關閉，以致影響攝影效果。因此，各個實驗室應根據所使用的熒光顯微鏡的具體情況，以手動控制自動摸索適宜的攝影條件。一般應首先使用黑白膠片在低倍鏡及高倍鏡下對中等熒光亮度的標本以不同曝光時間進行攝影，根據底片曝光效果找出合適的曝光時間。待積累一定經驗后再使用彩色膠片進行攝影。根據個人的經驗，以Olympus落射光型熒光顯微鏡為例，中等熒光亮度的標本，使用160ASA彩色膠片，于低倍鏡下攝影，曝光時間為1~2min即可，高倍鏡下攝影時曝光時間需延長1倍。曝光時間適宜之彩色膠片，洗印后熒光呈綠色；如呈現黃色，即為曝光過度，應減少曝光時間。一般在熒光顯微鏡攝影時，最好應準備3個照像機暗盒，分別拍攝彩色正片（作幻燈片用)、彩色負片（作實驗記錄用)及黑白負片（供發(fā)表文章 用)，以保存完整之資料。
必須指出，腎組織冰凍切片的免疫熒光染色法特異性強、敏感度高，對熒光標記物的分布部位、分布型式擴熒光強度顯示極為明確�？稍诮M織及細胞水平進行定位觀察，為國際上公認的較好觀察方法。但因其需要恒溫冷凍切片機、熒光顯微鏡等昂貴設備，且切片不能長期保存為其不足之處。
如未能及時制作冰凍切片，亦中使用石蠟切片進行熒光染色。石虹節(jié) 片需經二甲苯脫蠟，降酒精至水，用0.1%胰蛋白酶在37℃溫箱內消化20min，以暴露其抗原決定簇。再用各種熒光標記抗體按常規(guī)步驟進行染色后，熒光jfsoft.net.cn/rencai/顯微鏡觀察。石蠟切片之熒光觀察效果不佳，其結果僅可作為參考。
（二)免疫酶標細胞化學技術的應用
由于免疫熒光技術的應用受一定的條件限制，1966年Nakane 使用辣 根過氧化物酶（HRP)代替熒光素對抗體進行標記，通過酶的顯示使抗原定位，稱為酶標記抗體技術。其后，1969年Mason,1970年Sternberger又在基礎上發(fā)展了非標記酶抗體法。包括酶橋法和過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物法（PAP)。這一技術的建立，為醫(yī)學、生物學的各個領域提供了一個很好的研究手段，在免疫學和免疫病理學的研究和診斷工作中已日益廣泛應用。
1．免疫酶標技術及其進一步發(fā)展 免疫酶標細胞化學技術較免疫熒光細胞化學技術有不少優(yōu)點。首先，酶標法染色之切片使用普通的光學顯微鏡即可觀察，切片可以長期保存；用蘇木素進行細胞核的重復染色后，還能對組織結構和抗原進行細致確切的觀察和定位。PAP法的特異性和敏感性皆優(yōu)于熒光抗體法，且操作簡便，適合于一般實驗室應用（詳見第四章 )。
免疫酶標技術以明確的顏色（棕褐色或鮮紅色)顯示抗原沉積的形式（細線狀、顆粒狀或團塊狀)，又可精確地定位，不但可以判斷抗原沉積于腎小球毛細血管壁或系膜區(qū)，也可辨別出抗原在毛細基血管基底膜內外側的沉積部位。故免疫酶標法在此方面的優(yōu)于免疫熒光法，但其反應強度受力人為因素干擾較大（如作用時間的長短、抗體濃度的差別等)，且有時背景出現非特異性染色，而影響對結果的判斷。如果組織內源酶未消除干凈，亦可出現假陽性結果。
近年來，由于單克隆抗體的制備成功和應用，推動了免疫細胞化學技術的進一步發(fā)展。單克隆抗體是通過細胞融合技術，建立雜交瘤細胞株而產生的高純度抗體。由于免除了抗原種或株間的交叉反應，因而提高了抗原抗體反應的特異性和敏感性。在腎臟疾病的研究中，主要用于肝炎病毒抗原的檢測，如使用抗HBsAg或抗HBeAg單克隆抗體，用ABC法檢測腎小球中肝炎病毒抗原的存在部位和數量等。
目前，由于分子生物學的進展，原位核酸分子雜交技術已與免疫細胞化學技術相結合，而成為分子雜交免疫細胞化學技術（詳見第二十章 )。這一技術在病理學上的應用可以從核酸及其功能活動水平上，在細胞或組織的原位顯示有助于診斷或研究的信息。目前常使用乙型肝炎病毒（HBV)的DNA標記后作為探針，研究乙肝病毒相關性腎炎腎組織中HBV-DNA之存在狀態(tài)。
2．光學顯微鏡觀察及攝影技術由于免疫酶標技術的應用，使用光學顯微鏡可對腎組織內沉積的抗原性物質（包括免疫復合物)進行定性、定位及定量觀察。例如腎小球內沉積的IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白C1q、C3等補體成分以及纖維連接。蛋白（fibronectin)和HBV病毒抗原等的存在部位、分布形式和狀況及量的多少，并結合形態(tài)學觀察，研究其與形態(tài)學變化之間的關系。觀察時常需使用油鏡。觀察結果需進行攝影記錄。攝影時應使用研究用顯微鏡附有攝影設備及自動曝光裝置。攝影技術在具備自動曝光設備條件下簡便易行，但濾光片之選擇甚為重要。在拍攝彩色反轉片（制作幻燈片時)時，應使用燈光型彩色反轉片，濾光片無需使用，直接用鎢絲燈泡之黃光即可進行攝影。如使用普通之日光型彩色反轉片時 ，則需使用藍色濾光片。在拍攝彩色負片（制作彩色照片用時)，由于皆為日光型膠片，故需使用藍色濾光片。拍攝彩色膠片時，首先需注意膠卷之感光度，應將自動曝光裝置調至相應位置；另需在拍攝每張膠片前皆需調節(jié) 色溫，以保證獲得良好的彩色效果。在拍攝黑白膠片（供發(fā)表論文用)時，應使用綠色濾光片，以加強反差，提高攝影效果。
（三)電鏡免疫細胞化學技術的應用
免疫電鏡在細胞超微結構水平應用抗原與相應抗體能特異性結合的原理，使用標記抗體對細胞內存在的抗原性物質進行定性、定位和定量觀察，是免疫細胞化學技術在亞細胞水平的進一步發(fā)展。
1．免疫電鏡標本制備腎臟組織的免疫電鏡標本制備與一般透射電鏡標本的制備有所不同，其具體步驟如下：
（1)固定與包埋：腎臟組織一般采用低濃度戊二醛為固定劑，而不使用鋨酸，以盡可能多地保存抗原活性，常使用甲醛-戊二醛固定液（甲醛4%，戊二醛0.05%~0.5%)。包埋劑常使用 Lowicryl K4M（丙烯酸酯類化合物)或LRWhite 樹脂在-20~35℃低溫下包埋，以紫外線照射使之聚合。避免使用常規(guī)之環(huán)氧樹脂包埋，因環(huán)氧樹脂需加熱使之聚合，而使標本之抗原活性下降。
（2)修塊、定位及切片：包埋后之組織塊經初步修塊后，先在超薄切片機上用玻璃刀（勿用鉆石刀)切出一張0.5~1μm厚的半薄片，用1%鹼性復紅或美藍溶液進行染色，在光鏡下觀察組織內腎小球的數量及病變情況，挑選出一個病變最為典型的腎小球，作出標記。然后在組織塊上定出相應部位，用刀切去周圍組織，修成約0.1mm大小之組織塊，再用超薄切片機切出500 。A厚度的超薄切片。
（3)免疫標記：目前應用最多的是膠體金標記抗體（詳見第七章 )。
2．免疫電鏡觀察腎組織標本皆采用包埋后染色，第一抗體為特異性抗血清（如兔抗人IgG)，第二抗體為膠體金標記之抗體（如豬抗兔IgG，金標記Au10)。最后用枸椽酸鉛（或醋酸鉛)作對照染色，在透射電鏡下觀察。根據金顆粒的分布狀況，可作定位、定性及定量觀察，了解腎小球超微結構成分的變化、探討腎臟疾病的病原及研究免疫復合物（沉積之電子致密物質)的組jfsoft.net.cn/zhuyuan/成成分等（詳見后)。
腎臟疾病時，血清學檢查亦甚為重要，現僅就與免疫細胞化學有關者介紹如下：
1．血清或腎臟洗脫液內抗腎小球基底膜抗體的測定在快速進行性腎小球腎炎（RPGN)及Goodpasture綜合征病人血清中常存在有抗腎小球基底膜抗體，對病人血清進行檢查有重要的診斷意義。動物實驗中，對馬杉氏腎炎等實驗性腎小球腎炎動物，進行腎臟洗脫液的檢查，以確定有無抗腎小球基底膜抗體的存在。一般常用免疫細胞化學技術進行檢查，先將病人血清與靈長類（如猴等)的腎組織冰凍切片在37℃濕盒內孵育半小時，再將切片用FITC熒光素或HRP標記的抗人Igg 抗體處理。如果病人血清中存在有抗腎小球基底膜抗體，即可與切片上的腎小球基底膜相結合，進一步與熒光標記抗人IgG抗體相反應，而顯示沿腎小球毛細血管壁呈連續(xù)線形之熒光分布（酶標抗體亦顯示同樣之連續(xù)線形分布)。本方法又可用于與抗腎小管基底膜抗體和抗核抗體的鑒別。
2．血清中循環(huán)免疫復合物內IgG亞類的分析以3%聚乙二醇（PEG)沉淀病人血清中大分子蛋白質，分別使用鼠抗人IgG亞類IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的單克隆抗體，以ELISA法測定免疫復合物內IgG亞類的分布狀況。以同樣方法亦可測定腎小球中沉積的免疫復合物內的IgG亞類。Noel 報道，不同腎炎時腎小球內沉積之IgG亞類有所不同。原發(fā)性膜性腎炎之沉積物為Igg 1和IgG4，狼瘡性腎炎之沉積物為IgG1、IgG2和IgG3。
3．血清中Tamm-Horsfall糖蛋白（THP)的測定 THP是由腎小管髓袢升支厚壁段及遠曲小管上皮細胞合成的糖蛋白，主要存在于正常人的尿中，血清中含有微量。當腎功能減退時，血及尿中THP明顯降低，尿毒癥時則血及尿中幾乎測不出THP。目前可使用抗THP單克隆抗體，用ELISA夾心法測定血清中THP的含量。第一抗體使用鼠抗人THP單克隆抗體，第二抗體為HRP標記的兔抗鼠IgG。
4．其它血清中自身抗體如抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體等的測定，對狼瘡性腎炎有診斷意義�？怪z點抗體的測定對進行性系統(tǒng)性硬化（硬皮病)有診斷意義，以上測定皆使用免疫熒光法，具體操作不再贅述。
1．尿中THP測定如前所述，使用抗THP單克隆抗體進行測定。除在慢性腎功能損害時血中及尿中THP下降以外，目前提出當腎移植急性排斥反應時或毒性物質導致腎小管大量破壞時，尿中可出現THP升高。
2．尿中抗體包裹細菌的測定尿路感染可分為上尿路感染（腎盂腎炎)和下尿路感染（膀胱炎、尿道炎及前列腺炎)。上尿路感染時，細菌來源于腎組織，機體對細菌產生抗體而包裹于細菌表面，形成抗體包裹細菌（ACB)�？贵w為IgG、IgA或IgM組成，可用熒光素標記的抗人lgG、lgA、或lgM與之結合而使其顯示熒光。反之，下尿路感染之細菌，一般不能形成抗體包裹細菌，用免疫熒光檢查常為陰性，故能對上下尿路感染進行鑒別診斷。
3．尿沉渣中管型及粘液絲中免疫球蛋白之測定使用直接熒光進行觀察，腎小球腎炎病人尿沉渣中管型及粘液絲可觀察到IgG、IgA或IgM。一般認為是由于病變腎小球漏出之免疫球蛋白，與腎小球內沉積之免疫球蛋白可能無關。但泌尿系感染時尿中粘液絲中很少檢出免疫球蛋白。故本檢查有助于腎小球腎炎與泌尿系感染的鑒別。
腎小球的固有細胞有3種，即系膜細胞、臟層上皮細胞及內皮細胞。近年來隨著細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展，腎小球的體外培養(yǎng)亦受到了重視。1969年Bernik首先在體外培養(yǎng)腎小球成功，并初步培養(yǎng)出系膜細胞，1975年Fish 正式分離培養(yǎng)系膜細胞獲得成功，1978年Kreisberg分離培養(yǎng)上皮細胞成功，1984年Striker分離培養(yǎng)內皮細胞成功。目前，國內亦有不少單位從事腎小球細胞體外培養(yǎng)工作，已取得一定成績。腎小球細胞的體外培養(yǎng)，不僅限于正常人及兔、鼠等動物，目前亦發(fā)展至腎臟病人腎穿刺組織進行細胞培養(yǎng)。經體外培養(yǎng)的一生長之原代培養(yǎng)細胞需進行鑒定，除使用光學顯微鏡及電子顯微鏡觀察其形態(tài)及結構外，尚需進行免疫細胞化學染色而使用一系列免疫酶標記的相應抗體。例如使用抗結蛋白（desmin)單克隆抗體和抗肌動蛋白（actin)單克隆抗體（ABC試劑盒)，對上皮細胞進行鑒定，二者皆為強陽性。使用抗細胞角蛋白（cytokerfatin)單克隆抗體（ABC試劑盒)，對上皮細胞進行鑒定，以鹼性磷酸酶為底色，上皮細胞胞漿內可見紅色顆粒。內皮細胞之鑒定則使用抗Ⅷ因子單克隆抗體（因第Ⅷ因子只在內皮細胞內生成)。
此外，目前已認識到天很多生物活性因子如白細胞介素-1及6、血小板源性生長因子（PDGF)、轉化生長因子（TGFβ)、內皮素等皆可對系膜細胞、上皮細胞及內皮細胞起作用。使用其合成及分泌多種細胞因子如血小板活化因子、前列腺素E2、白細胞介素-1、6、8等。人們可應用分子雜交免疫細胞化學技術，探知系膜細胞、上皮細胞或內皮細胞中相應細胞因子mRNA的表達，從而了解在不同腎小球疾病中各種細胞功能的變化。對腎小球體外培養(yǎng)細胞的分子生物學研究，開拓了研究腎小球疾病機制的廣闊領域。
