DNA是染色體的主要組成部分，是PCR的擴(kuò)增模板。要進(jìn)行PCR，研究DNA結(jié)構(gòu)與功能或者用于診斷目的，首先必須從生物體內(nèi)提取DNA。DNA往往以核蛋白形式存在，其分子量大（人的染色體DNA平均大小為3.0×109bp)，提取DNA應(yīng)盡量保持DNA完整性和純度，即在提取中盡量避免機(jī)械張力引起的DNA分子降解，又要注意雜質(zhì)及蛋白的去除，防止胞內(nèi)酶解DNA。因此，提取DNA的基本過(guò)程是：用Proteinase K及SDS，在EDTA存在下，裂解細(xì)胞，消化蛋白質(zhì)，使核蛋白解聚及胞內(nèi)DNA酶失活，然后用酚/氯仿多次提取去除蛋白質(zhì)，在DNA中若混有少量RNA，可用RNase去除，最后用乙醇沉淀得到DNA。
理論上PCR對(duì)模板DNA純度及完整性要求并不高，細(xì)胞經(jīng)過(guò)熱變性使DNA釋出就可以作為模板，依賴(lài)引物的選擇性進(jìn)行擴(kuò)增。這對(duì)拷貝數(shù)很多的基因組，確實(shí)如此。但當(dāng)待擴(kuò)增的拷貝數(shù)甚少而無(wú)關(guān)細(xì)胞甚多時(shí)則擴(kuò)增就不易成功，其原因是：①非希望的擴(kuò)增增多，掩蓋了所需擴(kuò)增的片段，使其數(shù)量減少至不能檢測(cè)到的程度。②生物樣品中的雜質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)，最主要的是血液和瓊脂糖。例如在100μl反應(yīng)液中加入1μl全血就可引起抑制，0.8μmol/L的血紅素也會(huì)引起明顯的抑制。對(duì)于含血液的樣品，可以用滲透壓溶解紅細(xì)胞，離心集取細(xì)胞核，洗除血紅蛋白，再用蛋白酶/表面活性劑處理的方法來(lái)解決。另一簡(jiǎn)單的方法是煮沸之，使釋放DNA，并沉淀Hb，用上清液作PCR。
現(xiàn)將PCR前處理各種標(biāo)本的基本方法介紹如下：
1．所需溶液
（1)PBs 0.85% W/V NaCl,66mmol/L Na3PO4pH7.0
（2)含表面活性劑及蛋白酶K的PCR緩沖液
50mmol/LKCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.3) 2.5mmol/L MgCl2
0.1mg/ml明膠，0.45%NP40,0.45%吐溫20
高壓滅菌，冷凍儲(chǔ)存。臨用前加0.6μl的10mg/ml蛋白酶K（水溶液)至100μl溶液中。
（3)溶血緩沖液
0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl pH7.5
5mmol/LMgCl2,1% Triton X-100
2．提取方法
（1)用聚蔗糖-泛影葡胺梯度法從血液或培養(yǎng)細(xì)胞分離的單核細(xì)胞（當(dāng)PBC〈10%細(xì)胞數(shù)時(shí)用此程序)
①將jfsoft.net.cn/jianyan/細(xì)胞樣品用PBS稀釋至10ml，置15ml錐形離心管中；
②100×g離心2～5min，吸去上清；
③細(xì)胞再懸浮于10ml PBS中重新離心洗滌；
④沉淀物懸浮于溶液2中，使細(xì)胞濃度約為6×106/ml，移至1.5ml管中；
⑤50～60℃保溫1h；
⑥95℃保溫10min使蛋白酶變性；
⑦冷凍儲(chǔ)存。
如果RBC多于細(xì)胞的10%，則用PBS洗1次（步驟1，2)后，懸浮于1ml溶液3，并轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，如程序B-2離心1次，再懸浮于溶液2中按程序A-4繼續(xù)進(jìn)行。
（2)全血：此法使胞膜溶解故胞漿DNA丟失，約可得20μg DNA/0.5ml血。
①0.5ml全血與0.5ml溶液3共置1.5ml管中；
②13000×g離心20s；
③吸去上清，加1ml溶液3，旋渦混合使沉淀重新懸浮；
④重復(fù)第2，3步2次；
⑤13000×g離心2s，吸去上清，懸浮于0.5ml溶液2中；
⑥按程序A5～7步進(jìn)行。
（3)拭子
①用PBS預(yù)溫的試子從宮頸、陰道或陰莖采樣；
②拭子置入2ml PBS（含抗霉劑)于15ml離心管中，室溫可保存24h，置4℃可保存更長(zhǎng)時(shí)間。也可用旋渦混合器振蕩使細(xì)胞加速游離；
③取去拭子，2000～13000×g離心5min，吸去上清；
④如含RBC則加1ml溶液3，轉(zhuǎn)移至1.5ml E管中，按程序B-2開(kāi)始進(jìn)行；
⑤如不含RBC則加溶液2，按程序A-4進(jìn)行。
（4)頭發(fā)
①拔下頭發(fā)，剪下頭發(fā)近端0.5cm段；
②置入0.4ml溶液2中（1.5ml管)；
③按程序A5～7步進(jìn)行，用50μl體系作PCR。
（5)血細(xì)胞jfsoft.net.cn/zhicheng/RNA用焦碳酸二乙酯（DEP)抑制RNase,NP-40溶胞但不溶核。
①用聚蔗糖-泛影葡胺或其它方法分離單核細(xì)胞；
②置2ml離心管中，加PBS至細(xì)胞中，500×g離心5min；
③配制（DEP)溶液用無(wú)水乙醇將DEP作9+1稀釋?zhuān)儆肗P-400.5%作1：999稀釋?zhuān)ㄒ种芌Nase)；
④細(xì)胞沉淀中加200～400μl此溶液，旋渦混合；
⑤13000×g離心10s；
⑥上清轉(zhuǎn)移至新管中，37℃保溫20min，90℃，10min；
⑦離心，上清轉(zhuǎn)移至新管。取5～10μl作反轉(zhuǎn)錄；
⑧如果反轉(zhuǎn)錄失敗，可能因DEP殘留，可將樣品再在90℃加熱5min，再做試驗(yàn)；
⑨本法也可用于培養(yǎng)細(xì)胞。
PCR只需幾個(gè)DNA分子作模板就可大量擴(kuò)增，應(yīng)注意防止反應(yīng)體系被痕量DNA模板污染和交叉污染，這是造成假陽(yáng)性最大的可能。下例可形象說(shuō)明污染的嚴(yán)重性。
典型的PCR反應(yīng)可在100μl反應(yīng)液中擴(kuò)增1012個(gè)DNA，此液傾入50nm×25m×2m的游泳池中，充分混合取0.1ml池水,其中含有40個(gè)分子的DNA,用PCR擴(kuò)增即已可呈陽(yáng)性，這一點(diǎn)對(duì)檢測(cè)HIV更為重要。常規(guī)只要15個(gè)拷貝的核酸即可查出。假陽(yáng)性結(jié)果往往來(lái)自痕量污染和交叉污染，尤其在待擴(kuò)增靶序列濃度低的情況下，更有必要采取防備措施。
（1)DNA處理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有緩沖液吸頭、離心管等用前必須高壓處理，常規(guī)消耗用品用后作一次性處理，避免反復(fù)使用造成污染。
(2)PCR在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作前后紫外燈消毒。
超凈臺(tái)內(nèi)設(shè)內(nèi)供PCR用微量離心機(jī)、一次性手套、整套移液器和其它必須品；移液品用一次性吸頭和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。
（3)PCR操作應(yīng)戴手套并勤于更換。
（4)成套試劑，小量分裝，專(zhuān)一保存，防止它用。配制試劑用新器具，用后作一次性處理。
（5)試劑管用前先瞬時(shí)離心（10s)，使液體沉于管底，減少污染手套與加樣器機(jī)會(huì)。
（6)最后加模板DNA（包括在石蠟油后)，馬上蓋好，混勻，瞬時(shí)離心（10s)，使水相與有機(jī)相分開(kāi)。加入模板且忌噴霧污染，所有非即用管都應(yīng)蓋嚴(yán)。加模板DNA后應(yīng)更換手套。
（7)實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性、陰性對(duì)照。
