血漿中脂蛋白有多種,測(cè)定其各自的含量對(duì)于了解機(jī)體正常及疾病過程中脂質(zhì)代謝狀況有重要的臨床意義。HDL是一組不均一的脂蛋白顆粒,其膽固醇含量占血漿總膽固醇量的25%~35%。由于血漿中所有脂蛋白均含有膽固醇,因此,只有先分離出HDL才能對(duì)其進(jìn)行定量。分離HDL的方法中,沉淀法是目前臨床使用最多的方法,操作簡便快速。沉淀法原理是利用多聚陰離子和二價(jià)陽離子共同作用于脂蛋白,并選擇性地使含ApoB的VLDL和LDL脂蛋白沉淀,再測(cè)定含HDL的上清液膽固醇,即高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。定量HDL全量是很困難的,因?yàn)樗堑鞍踪|(zhì)和脂類的混合物,故以測(cè)定HDL中所含膽固醇含量作為HDL定量依據(jù)。
要測(cè)定血清中HDL-C,就必需先沉淀HDL以外的脂蛋白,即VLDL和LDL。使血清中VLDL和LDL沉淀的試劑很多,常用的有四種:①肝素-錳沉淀法,該法操作簡便易行,一旦遇上血脂升高的標(biāo)本,有沉淀不完全的差異;②硫酸葡聚糖-鎂法,該法也簡單易行,試劑較貴而難買到;③聚乙二醇法,雖然簡便易行,若遇高脂血癥標(biāo)本,其重復(fù)性差;④磷鉬鎢酸-鎂法,操作簡便易行,結(jié)果準(zhǔn)確,是目前臨床推薦使用的方法;⑤另有一種不沉淀VLDL和LDL也可直接測(cè)定HDL的方法,稱之為直接測(cè)定法。其原理是,先用一種封阻血清VLDL和LDL,而不封阻HDL,當(dāng)測(cè)膽固醇的酶試劑加入后,酶可作用于HDL的膽固醇進(jìn)行化學(xué)反應(yīng),測(cè)出其濃度,但酶試劑就無法使已被試劑封阻的VLDL和LDL的膽固醇進(jìn)行反應(yīng),這種直接法操作更為簡便,無需離心等繁雜步驟,便于在自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行HDL-C測(cè)定,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,缺點(diǎn)是成本過高。下面僅介紹目前推薦使用的方法。
(一)原理
磷鎢酸-鎂(PTA-Mg2+)沉淀血清中含ApoB的脂蛋白(VLDL、LDL),上清液中只含HDL,用酶法測(cè)定上清液中膽固醇,即HDL-C。
生成的醌亞胺與HDL中的CE及FC成正比。
2.試劑組成
(1)沉淀劑磷鎢酸鈉4g溶于50ml雙蒸水中,加入1mol/l NaoH16ml,充分?jǐn)嚢韬,再加雙水至100ml,調(diào)pH到7.6。再取40ml此溶液,加2mol/l MgCl210ml,混勻,再加水至100ml,此為應(yīng)用液。
(2)膽固醇酶法測(cè)定試劑(同第十五章)
(3)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)參考液(同第十五章)
3.操作
(1)空腹12h,抽取靜脈血,不抗凝,分離血清備測(cè)。于24h內(nèi)操作完畢。
(2)其他操作同前。
4.注意事項(xiàng)
(1)室溫以15~20℃為宜,<15℃或>30℃時(shí)應(yīng)增加或減少靜置時(shí)間,離心轉(zhuǎn)速要恒定一致。
(2)離心沉淀后,要立即吸出上清進(jìn)行測(cè)定,否則結(jié)果偏離不準(zhǔn)。
(3)若血清TC超過500mg/dl時(shí),上清液會(huì)出現(xiàn)混濁,表明有部分膽蛋白漂浮在上清液中未沉淀完全,此時(shí)將血清稀釋重新沉淀,其所測(cè)值乘以稀釋倍數(shù)。
(二)血清HDL-C選擇遮敝直接測(cè)定法。
1.原理
含反應(yīng)抑制劑的陰離子表面活性劑加入血清中后,與CM、VLDL和LDL緊密結(jié)合,少量與HDL結(jié)合。爾后,再加入反應(yīng)促進(jìn)劑的聚陰離子表面活性劑后,HDL溶化并釋放出膽固醇,與膽固醇測(cè)定試劑進(jìn)行反應(yīng),達(dá)到僅測(cè)出高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)的目的,其反應(yīng)全過程為:
2.試劑(第一化學(xué))
RⅠ:前處理液(第一反應(yīng)液)
RⅡ:第二反應(yīng)液(可溶性表面活性劑)及顯色液
HDL-C參考血清
3.操作
按雙試劑雙波長法在CL-7200型全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè),有關(guān)參數(shù)如表16-1所示。
表16-1 HDL-C檢測(cè)參數(shù)
名稱 | 參數(shù) |
分析方式www.med126.com | 終點(diǎn)法 |
標(biāo)本用量 | 3μl |
RⅠ體積 | 300μl |
RⅡ體積 | 100μl |
第一試劑時(shí)間 | 3~4min |
第二試劑時(shí)間 | 5~6min |
雙波長 | [560][600]nm |
標(biāo)本濃度按△A=A2-A1的吸光度計(jì)算
4.特點(diǎn)
(1)直接測(cè)定,無需預(yù)處理。
(2)操作簡便,減少影響準(zhǔn)確性的因素。
(3)標(biāo)本及試劑用量少,準(zhǔn)確性高。
(4)抗干擾能力強(qiáng),適合于自動(dòng)化分析。
(5)該法CV為5%以下,回收率90%~110%。線性范圍(0~5.85mmol/L)。
5.注意事項(xiàng)
(1)待測(cè)血清標(biāo)本于當(dāng)日測(cè)試,2~8℃保存,一周內(nèi)測(cè)定,-20℃長期保存,對(duì)測(cè)定結(jié)果無影響。
(2)干擾物維生素C500mg/L、膽紅素200mg/L、Hb5.0g/L以下均不影響測(cè)定結(jié)果。
LDL是一組不均一的脂蛋白顆粒,其膽固醇含量約占總膽固醇的45%~50%。
測(cè)定血漿中LDL,首先同樣要分離LDL,其分離方法有超速離心法、聚陰離子沉淀法、色譜法、電泳法及計(jì)算法等。以聚陰離子沉淀法簡便易于操作,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。由于直接測(cè)定LDL有一定的困難,因?yàn)樗堑鞍踪|(zhì)脂類組成的顆狀結(jié)構(gòu),膽固醇是其較為衡定的因素,因此采用測(cè)定LDL中所含的膽固醇的濃度作為LDL定量的依據(jù)。
另外,還可以通過用Friedwal公式計(jì)算,主要是利用血清TC、TG及HDL-C濃度測(cè)定結(jié)果,即LDL-C=TC-HDL-C-(1/5)TG。對(duì)脂代謝異常的高脂血癥,不能按此方法計(jì)算結(jié)果。
(一)聚乙烯硫酸鹽(PVS)法
1.原理
生成的醌亞胺與上清液的TC含量成正比。
2.試劑組成
(1)沉淀劑:聚乙烯硫酸鉀鹽0.7g/L、聚乙二醇獨(dú)甲醚170g/L、乙二胺四乙酸5mmol/L,混勻,4~21℃避光可保存一年。
(2)酶法膽固醇測(cè)定試劑(同第15章)。
(3)膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液:2.58mmol/L。
3.操作
(1)空腹12h,采靜脈血,3h內(nèi)分離完成血清以免脂蛋白之間相互交換和防止LDL降解。-70℃可以保存數(shù)月之久。
(2)取200μl血清置于含有沉淀劑100μl試管中充分混勻,室溫放置15min,3000r/min離心,留上清測(cè)定膽固醇。
(3)按下表進(jìn)行操作:
空白管 | 測(cè)定管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | |
上清液(μl) | 30 | ||
定值血清(μl) | 30 | ||
水(μl) | 30 | ||
膽固醇酶試劑(μl) | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
混勻,37℃6min,以空白管調(diào)零(500nm),讀取光密度。
(4)計(jì)算
血清LDL-C=TC-上清液膽固醇
(5)注意事項(xiàng)
標(biāo)本沉淀過程嚴(yán)格按要求進(jìn)行。吸取上清液時(shí),注意輕吸,別攪動(dòng)沉淀。
PVS法能將Lp(α)完全沉淀,一般情況下,正常人含量極少,一旦高脂血癥、Lp(α)增高時(shí),其測(cè)定值LDL-C應(yīng)為LDL-C和Lp(α)-C之和。
(二)血清LDL-C直接測(cè)定法
1.原理
含反應(yīng)活性劑的試劑Ⅰ加入血清后,與HDL、VLDL和CM反應(yīng),使其膽固醇水解并與酶反應(yīng)生成無色產(chǎn)物溶于介質(zhì)中。再加入含溶解LDL的活性劑Ⅱ試劑,使LDL水解并與其中的膽固醇試劑進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)生成紅色化合物,定量血清中LDL-C。
以△A=A2-A1進(jìn)行運(yùn)算,測(cè)出LDL-C的含量
2.試劑(第一化學(xué))
R1:去垢劑1、COD、POD、4-AAP。
R2:去垢劑2、DSBmT。
3.操作
按CL-7200型或其他型號(hào)全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè),有關(guān)參數(shù)如表16-2所示。
表16-2 LDL-C檢測(cè)參數(shù)
名稱 | 參數(shù) |
分析方式 | 終點(diǎn)法 |
標(biāo)本用量(μl) | [3] |
R1體積(μl) | [300] |
R2體積(μl) | [100] |
第一試劑時(shí)間 | 5min |
第二試劑時(shí)間 | 5min |
波長(nm) | [560][600] |
4.特點(diǎn)
(1)直接測(cè)定,無需預(yù)先處理。
(2)操作簡便,減少影響準(zhǔn)確性的因素。
(3)標(biāo)本及試劑用量少,準(zhǔn)確性高。
(4)抗干擾能力強(qiáng),適合于自動(dòng)化分析。
(5)該法CV為5%以下,回收率90%~110%,線性范圍0~88mmol/L。
5.注意事項(xiàng)
待測(cè)血清標(biāo)本于當(dāng)日測(cè)試,2~8℃一周內(nèi)保存,-20℃以下長期保存,結(jié)果均不受影響。
聚乙二醇20000沉淀法
1.原理:
HDL中主要組份為HDL2和HDL3。用聚乙二醇20000(PEG20000)作沉淀劑,以不同濃度在不同pH條件下,可將HDL2和HDL3分離開。95g/L聚乙二醇20000在pH6.5環(huán)境下可將血清中低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)沉淀,離心后上清液中只含HDL。170g/L聚乙二醇20000在pH7.5環(huán)境中,可將LDL、VLDL、HDL2沉淀,離心后上清液中只含HDL3,以酶試劑側(cè)定各自上清液中膽固醇含量,通過換算,計(jì)算出代表HDL各亞組分含量。
2.試劑:沉淀劑Ⅰ:95g/L PEGjfsoft.net.cn/shiti/20000,pH6.5
沉淀劑Ⅱ:170g/LPEG20000,pH7.5。
膽固醇酶應(yīng)用液及參考血清以試劑盒而定。
3.操作方法:(以生化分析儀為例)按表16-3操作
表16-3 HDL-C亞組分測(cè)定操作步驟
加入物 | 1管 | 2管 |
血清 | 100 | 100 |
沉淀劑Ⅰ(μl) | 200 | - |
沉淀劑Ⅱ(μl) | - | 200 |
置混勻器上混勻2min,置室溫10min,3000r/min離心20min,上清液待測(cè)。
上清液于生化分析儀測(cè)定,測(cè)定參數(shù)參照總固醇測(cè)定法。
5.結(jié)果計(jì)算
HDL-C=上機(jī)測(cè)得結(jié)果×血清稀釋倍數(shù)
HDL3-C=上機(jī)測(cè)得結(jié)果×血清稀釋倍數(shù)
HDL2-C=HDL-C×HDL3
6.注意事項(xiàng):
離心時(shí)間及速度一定要準(zhǔn)確;
離心上清液混濁者應(yīng)繼續(xù)離心直到清亮止;
1.原理
血漿(清)中脂蛋白(α)(Lp(α))與Lp(α)的單克隆抗體(鼠)結(jié)合形成抗原抗體免疫復(fù)合物,有濁度改變,測(cè)定溶液界質(zhì)中混濁度的光密度改變,求其血漿中Lp(α)的含量。
Lp(α)+抗人Lp(α)→抗原抗體復(fù)合物→測(cè)定光密度
2.試劑與儀器
試劑(第一化學(xué));Lp(α)緩沖液(R1);Lp(α)抗體液(R2)。
儀器:生化分析儀(以CL-7200型為例)
3.操作方法
以△A=A2-A1進(jìn)行運(yùn)算Lp(α)濃度。
4.定標(biāo):
取Lp(α)定值液,用0.9%NaCl液稀釋。
采用上述操作步驟,按免疫測(cè)定法定標(biāo),其操作方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖16-3所示。
圖16-3 Lp(α)免疫測(cè)定法的反應(yīng)過程光密度變化值mAbs(A)及其檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(B)(CL-7200型)
上機(jī)參數(shù)(以CL-72OO型為例)
名稱 | LPA | 名稱 | LPA | |
測(cè)定方法 | Endpoint | 標(biāo)準(zhǔn)(1) | 0.72 | |
標(biāo)本量 | 16μl | 標(biāo)準(zhǔn)(2) | 1.44 | |
R1試劑量 | 280μl | 標(biāo)準(zhǔn)(3) | 2.88 | |
R2試劑量 | 40μl | 標(biāo)準(zhǔn)(4) | 5.75 | |
反應(yīng)時(shí)間 | 第一波長 | 5min | 標(biāo)準(zhǔn)(5) | 11.5 |
第二波長 | 4.99min | 波長1.2 | [340][750] |
5.注意事項(xiàng):
(1)操作時(shí),標(biāo)本和試劑無需處理;
(2)血漿或血清標(biāo)本均可檢測(cè)。標(biāo)本置2~21℃保存1周不變;
(3)標(biāo)本濃度超過定標(biāo)最高值時(shí),應(yīng)用生理水稀釋后再測(cè);
(4)抗體試劑(R1)避免反復(fù)接觸;
(5)測(cè)定時(shí)避免日光直接照射。
1.原理
血清脂蛋白x的組成中磷脂占66%,蛋白質(zhì)僅占6%,在電場(chǎng)中因電荷少,選擇電滲大小合適的瓊脂為電泳支持物,則LpX向陰極移動(dòng),而其他蛋白質(zhì)向陰極移動(dòng),從而達(dá)到分離的目的。用免疫沉淀法或聚陰離子沉淀法使其在瓊脂板上沉淀,對(duì)于LpX陽性的血清可以在加樣孔的陰極端見到白色沉淀帶。
2、試劑
巴比妥緩沖液500mmol/L:pH8.6,離子強(qiáng)度0.05。
1%瓊脂用上述巴比妥緩沖液加熱配制。
沉淀劑;每升中含MgCl20.1mol,肝素2.5g及MaCl9g。
3.儀器:電泳儀。
4.操作:
(1)制板 1%瓊脂糖加熱未冷卻前于一潔凈載玻片上均勻鋪開。凝固后在一端2cm~3cm處打孔(直徑約2.5mm)。
(2)電泳 將血清20μl加于小孔內(nèi)(勿使外溢和有氣泡)。按瓊脂糖脂蛋白電泳操作、搭橋、通電1mA、40min。
(3)漿瓊脂玻片浸在沉淀劑中30min后觀察結(jié)果(如Lp-x陽性,數(shù)min內(nèi)即出現(xiàn)沉淀線),Lp-x濃度到3.3mg/dl上即可出現(xiàn)陽性反應(yīng)。
正常值:正常人血清無Lp-x帶。
(儲(chǔ)建中 吳翠華)