高特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)鑒別中藥材烏梢蛇真?zhèn)蔚姆椒?/H1>
公開(公告)號
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CN1236071C
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公開(公告)日
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2006.01.11
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申請(專利)號
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CN200410006374.0
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申請日期
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2004.03.01
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專利名稱
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高特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)鑒別中藥材烏梢蛇真?zhèn)蔚姆椒?
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主分類號
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C12Q1/68(2006.01)I
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分類號
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C12Q1/68(2006.01)I
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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中國中醫(yī)研究院中藥研究所
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發(fā)明(設(shè)計)人
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黃璐琦;馮成強;唐曉晶
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地址
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100700北京市東直門內(nèi)南小街16號
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頒證日
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國際申請
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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代理人
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國省代碼
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北京;11
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主權(quán)項
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一種高特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)鑒別真?zhèn)螢跎疑叩姆椒,其特征在于包括DNA模板提取、PCR擴增、電泳檢測三個步驟;①模板DNA的提。哼x取無霉變和蟲蛀的藥材肌肉部分1g,置于研缽中經(jīng)液氮速凍后研成粉末,將粉末速轉(zhuǎn)移至50mL離心管中,加入6mL已滅菌的勻漿緩沖液,勻漿緩沖液由蔗糖0.25mol/L,Tris-Hcl10mmol/LPH=8.0,Na2EDTA1mmol/LPH=8.0組成,加入蛋白酶K至終濃度為150μg/mL,再加入10%SDS至終濃度為0.8%;55℃水浴3-4小時,其間輕搖數(shù)次,取出冰浴至4℃,400g離心5分鐘,取上清液,加入等體積Tris飽和酚抽提,混勻10分鐘,兩相成乳狀,5000g離心15分鐘,取上層水相,重復(fù)一次,再用CHCl3抽提兩次,CHCl3抽提離心后取上層水相加入兩倍無水乙醇沉淀DNA,-20℃冰箱中過夜;第二天取出,5500g離心15分鐘,沉淀物用70%乙醇洗滌兩次,室溫?fù)]干乙醇,用適量TE溶解DNA,-20℃?zhèn)溆;②PCR擴增:PCR反應(yīng)體系30μl含10mmol/lTris-HClPH=8.0,50mmol/lKCl,0.1%TritonX-100,1.5mmol/lMgCl2,1.5mmol/1dNTPs,兩種高度特異性鑒別引物HWL-1即5’-GCGAAAG-CTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’和HWH-1即5’-CAGGCTCCTCTA-GGTTGTTATGGGGTACCG-3’,各10pmol/L,DNA模板約100ng,反應(yīng)在PTC-100基因擴增儀上進(jìn)行擴增;循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性4分鐘;95℃變性40秒,65℃退火1分鐘,72℃延伸30秒;10個循環(huán);95℃變性40秒,60℃退火1分鐘,72℃延伸30秒;15個循環(huán);72℃延伸5分鐘;③電泳檢測:PCR實驗中設(shè)置無模板DNA的陰性對照,反應(yīng)完成后,取5μL反應(yīng)液經(jīng)溴化乙錠染色,1.8%瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像觀察,在310bp-320bp范圍內(nèi)處擴增出明亮唯一條帶的樣品即為正品烏梢蛇,混淆品均應(yīng)無任何條帶出現(xiàn)。
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摘要
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本發(fā)明是利用DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)鑒別中藥材烏梢蛇真?zhèn)蔚姆椒。設(shè)計了一對高特異性鑒別引物,通過高特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)鑒別中藥材烏梢蛇與市場上常見的偽品:滑鼠蛇、黑眉錦蛇、紅點錦蛇、王錦蛇、赤鏈華游蛇、玉斑錦蛇、赤鏈蛇、灰鼠蛇、眼鏡蛇、三索錦蛇。使用此方法鑒別烏梢蛇的真?zhèn),只通過簡單的烏梢蛇及其偽品的DNA提取、PCR特異性擴增、電泳檢測三步即可完成對藥材真?zhèn)蔚蔫b別。操作簡單、易于掌握、準(zhǔn)確性高。
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國際公布
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