| 公開(公告)號 | CN1314804C |
| 公開(公告)日 | 2007.05.09 |
| 申請(專利)號 | CN200510026025.X |
| 申請日期 | 2005.05.20 |
| 專利名稱 | 內(nèi)源基因超量表達(dá)技術(shù)提高黃芪甲苷含量 |
| 主分類號 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/10(2006.01)I;C12N15/54(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I;C12N15/87(2006.01)I;C12N15/82(2006.01)I;C12N5/04(2006.01)I;C12N15/70(2006.01)I;C12N15/74(2006.01)I;A01H4/00(2006.01)I;A61K36/481(2006.01)I;A61P9/10(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 上海中醫(yī)藥大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 杜 旻;胡之璧;劉 滌;周吉燕;王子艷;倪躍元 |
| 地址 | 201203上海市浦東新區(qū)蔡倫路1200號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海新天專利代理有限公司 |
| 代理人 | 王 巍 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種內(nèi)源基因超量表達(dá)技術(shù)提高黃芪甲苷含量的方法，其特征在于：包括下列步驟：1)總核糖核酸提取：反應(yīng)試劑的配制：變性液26mM檸檬酸鈉pH 4.0，0.5％十二烷基肌氨酸鈉，0.125M 2-巰基乙醇，4M異硫氰酸胍；NaAc2M，pH 4.7；酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1；70％乙醇；所有的試劑皆用0.1％焦碳酸二乙酯水處理過的無核糖核酸酶水配制，玻璃容器皆去核糖核酸酶；操作程序：取適量新鮮植物組織置于陶瓷研缽中，加入液氮快速研磨至細(xì)粉末，轉(zhuǎn)移至含有650μl變性液的1.5ml離心管中混勻；加入65μl 2M NaAc pH 4.0，反復(fù)顛倒混勻；再加入650μl酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1，混勻，冰浴15min；4℃，12000rpm，離心20min；上清轉(zhuǎn)移至一新的1.5ml離心管中，加等體積異丙醇，混勻后-20℃置30min；4℃，12000rpm，離心10min沉淀核糖核酸；棄上清液，將核糖核酸溶于0.5ml變性液中，65℃加熱盡快溶解；加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇，混合溶液重新抽提1次，即重復(fù)前步驟；離心后，棄上清液，加75％預(yù)冷乙醇1ml，漂洗沉淀，離心同上，棄上清；空氣干燥后，加20μl無菌雙蒸去離子水溶解核糖核酸，分光光度法和凝膠電泳檢測濃度和純度，余下部分-20℃保存?zhèn)溆茫?)逆轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)脫氧核糖核酸寡聚脫氧胸苷酸37.5μM 2μl，總核糖核酸10μg，無菌雙蒸去離子水10.5μl，70℃反應(yīng)10min，立即置冰上，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl，核糖核酸酶抑制劑40U/μl 0.5μl，10mM脫氧核酸核苷三磷酸1μl，逆轉(zhuǎn)錄酶200U/μl 1μl，42℃反應(yīng)1.5h，70℃反應(yīng)10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；3)引物設(shè)計(jì)根據(jù)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因和腺苷二磷酸葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的互補(bǔ)脫氧核糖核酸序列設(shè)計(jì)引物P2：5’-tcgagccttacaggtcctttgg-3’，PxbaI：5’-tttctaatggccaccgctactgc-3’P20：5’-cctctagatgttgctcttactgctctctc-3’，P21：5’-ccgagctctgtggctcaaaatccttctg-3’構(gòu)建雙基因載體時擴(kuò)增引物為：Psf：5’-cagaagtactattccagtatgacg-3’，Psr：5’-tttcatgatctagtaacatagtgacac-3’4)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增互補(bǔ)脫氧核糖核酸1μl，引物15μM 2μl，引物25μM 2μl，10×緩沖液2μl，MgCl2 25mM1.6μl，脫氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脫氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，無菌雙蒸去離子水94℃變性5min→94℃變性0.5min→60℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→30個循環(huán)→72℃延伸7min；5)連接pGEM-T載體：T4脫氧核酸緩沖液10×1μl，pGEM easy載體50ng/μl 1μl，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)純化產(chǎn)物適量，T4脫氧核酸連接酶3U/μl 1μl，無菌雙蒸去離子水，將反應(yīng)液混勻后4℃放置；6)感受態(tài)細(xì)菌的制備：從-70℃低溫冰箱取出菌種DH5α，接種于LB平板，37℃培養(yǎng)過夜進(jìn)行活化，從活化平皿上挑取單菌落，接入5ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜250rpm，次日按1％V/V比例轉(zhuǎn)入新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)至OD600＝0.3～0.6也可，在無菌條件下，將50～100ml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入兩個預(yù)冷的無菌離心管中，冰上靜置10min，4℃，4000rpm離心10min，棄去上清液，倒置流盡培養(yǎng)液，加10ml預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液，重懸浮細(xì)菌，冰浴30min，4℃，4000rpm離心10min，棄去上清液，加2ml預(yù)冷的0.1M CaCl2溶液，重懸浮細(xì)菌，即為感受態(tài)細(xì)胞；7)轉(zhuǎn)化與克隆篩選在制得的感受態(tài)細(xì)胞中加4μl載體連接質(zhì)粒脫氧核酸，冰浴30min后，于42℃熱激1.5min，冰上冷卻1～2min；加入SOC培養(yǎng)基800μl，于37℃，180rpm搖床培養(yǎng)1hr；取培養(yǎng)物100μl鋪LB平板加相應(yīng)的篩選抗生素，再加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷各5μl，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，根據(jù)藍(lán)白斑篩選陽性克隆；8)分別以引物對腺苷二磷酸葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因特征引物P20-P21、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因特征引物Pxbai-P2擴(kuò)增腺苷二磷酸葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因模板1μl，引物15μM 2μl，引物5μM 2μl，10×緩沖液2μl，MgCl225mM 1.6μl，脫氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脫氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，無菌雙蒸去離子水94℃變性5min→94℃變性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→3個循環(huán)→94℃變性0.5min→55℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→27個循環(huán)→72℃延伸7min，測序；9)雙酶切：10×雙酶切緩沖液10μl，限制性核酸內(nèi)切酶XbaI 10U/μl 3μl，限制性核酸內(nèi)切酶SacI 10U/μl 3μl，脫氧核糖核酸10μg，無菌雙蒸去離子水37℃水浴1hr，取出75℃滅活內(nèi)切酶，取5μl電泳鑒定，其余部分酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1純化后，加1/10體積的3M NaAc，2體積的乙醇沉淀脫氧核糖核酸，靜置10min后，12000rpm，4℃，離心10min，沉淀用70％乙醇洗滌兩次后晾干約10min，加適量的無菌水溶解，進(jìn)行與載體的連接或者-20℃保存待用；10)質(zhì)粒pBI121的提取、雙酶切反應(yīng)試劑的配制：LB液體培養(yǎng)基；溶液150mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM乙二胺四乙酸，pH 8.0；溶液20.2M NaOH，1％十二烷基硫酸鈉；溶液35M KAc 60ml，HAc 11.5ml，無菌雙蒸去離子水28.5ml；酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1混合液；核糖核酸酶 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種內(nèi)源基因超量表達(dá)技術(shù)提高黃芪甲苷含量的方法。本發(fā)明將多糖代謝途徑的兩個代謝反應(yīng)偶連的關(guān)鍵酶基因ugp基因(尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因)和gbss基因(腺苷二磷酸葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶基因)，經(jīng)體外修飾，增加強(qiáng)化表達(dá)的調(diào)控元件，構(gòu)建成功中間載體，通過電穿孔法將表達(dá)中間載體pBI-UG轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌LBA-9402，獲得轉(zhuǎn)多糖合成雙基因的黃芪毛狀根。其中黃芪甲苷的含量比未轉(zhuǎn)基因的黃芪毛狀根高6倍。 |
| 國際公布 |
