白細(xì)胞介素－2基因在慢性疼痛應(yīng)用中的測試方法
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公開(公告)號(hào)
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CN1193104C
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公開(公告)日
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2005.03.16
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申請(qǐng)(專利)號(hào)
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CN02111639.3
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申請(qǐng)日期
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2002.05.10
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專利名稱
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白細(xì)胞介素－2基因在慢性疼痛應(yīng)用中的測試方法
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主分類號(hào)
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C12Q1/68
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分類號(hào)
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C12Q1/68
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分案原申請(qǐng)?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(qǐng)(專利權(quán))人
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中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
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發(fā)明(設(shè)計(jì))人
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姚明忠;顧錦法;王晉慧;孫蘭英;劉新垣
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地址
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200031 上海市徐匯區(qū)岳陽路320號(hào)
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頒證日
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國際申請(qǐng)
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進(jìn)入國家日期
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專利代理機(jī)構(gòu)
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上海新天專利代理有限公司
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代理人
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王巍
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國省代碼
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上海;31
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主權(quán)項(xiàng)
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一種白細(xì)胞介素-2基因在慢性疼痛應(yīng)用中的測試方法，其特征在于該方法包括下列步驟：(1)pcDNA3-IL-2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接頭的全長的含信號(hào)肽的人IL-2cDNA，462bp，克隆入經(jīng)相同酶切的pcDNA3載體，IL-2基因在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109擴(kuò)增，堿裂解法制備質(zhì)粒，聚乙二醇沉淀法純化，通過測定260nm的光吸收來確定質(zhì)粒濃度，注射時(shí)質(zhì)粒稀釋于含5％葡萄糖的磷酸鹽緩沖液中；(2)重組腺病毒Ad5-IL-2的構(gòu)建人IL-2基因經(jīng)EcoRI和XhoI酶切得到有EcoRI和XhoI接頭的全長的含信號(hào)肽的人IL-2cDNA，462bp，克隆入經(jīng)相同酶切的pCA13載體，IL-2基因在CMV啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，pCA13-IL-2與腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG10共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行同源重組，篩選重組腺病毒，擴(kuò)增純化腺病毒，注射時(shí)病毒稀釋于含5％蔗糖的磷酸鹽緩沖液中；(3)慢性神經(jīng)病理痛模型的建立大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷建立慢性神經(jīng)病理痛；(4)外周炎癥痛模型的建立大鼠后肢跖部皮下注射角叉菜膠建立外周炎癥痛模型；(5)測試IL-2基因?qū)β蕴弁吹挠绊慽)pcDNA3質(zhì)粒介導(dǎo)IL-2基因?qū)β陨窠?jīng)病理痛的測試：大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷手術(shù)后30天，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管，鞘內(nèi)分別注射5％葡萄糖PBS，50μglipofectamine，25μgpcDNA3，25μgpcDNA3/50μglipofectamine，10μgpcDNA3-IL-2，10μgpcDNA3-IL-2/20μglipofectamine，25μgpcDNA3-IL-2，25μgpcDNA3-IL-2/50μglipofectamine，n＝12-14，注射總體積為30μl，注射后每天測定傷害性輻射熱所致縮腿反射潛伏期，連續(xù)7天；ii)腺病毒載體介導(dǎo)IL-2基因?qū)β陨窠?jīng)病理痛的測試：大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷手術(shù)后2周，經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管，鞘內(nèi)分別注射5％蔗糖PBS，5×107pfuAd5，5×107pfuAd5-IL-2，n＝15-18，注射總體積為10μl，注射后每周測定傷害性輻射熱所致縮腿反射潛伏期，連續(xù)5周；iii)pcDNA3介導(dǎo)IL-2基因?qū)ν庵苎装Y痛的測試大鼠經(jīng)第5與第6腰椎之間插入導(dǎo)管，鞘內(nèi)或后肢跖部皮下注射5％葡萄糖PBS，50μglipofectamine，25μgpcDNA3，25μgpcDNA3/50μglipofectamine，10μgpcDNA3-IL-2，10μgpcDNA3-IL-2/20μglipofectamine，25μgpcDNA3-IL-2，25μgpcDNA3-IL-2/50μglipofectamine，n＝8-10，注射總體積為30μl，2天后大鼠相同后肢跖部皮下注射角叉菜膠，注射后2.5小時(shí)測定傷害性輻射熱所致縮腿反射潛伏期；(6)統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析。
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摘要
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本發(fā)明屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了白細(xì)胞介素-2基因在慢性疼痛應(yīng)用中的測試方法。通過采用腺病毒載體和pcDNA3質(zhì)粒介導(dǎo)IL-2基因轉(zhuǎn)移至蛛網(wǎng)膜下腔、病灶局部治療慢性疼痛，用基因療法使IL-2鎮(zhèn)痛效應(yīng)時(shí)間延長以達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的目的。
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國際公布
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評(píng)論加載中...
