| 公開(公告)號 | CN1746302A |
| 公開(公告)日 | 2006.03.15 |
| 申請(專利)號 | CN200510044079.9 |
| 申請日期 | 2005.07.18 |
| 專利名稱 | 利用酵母生產(chǎn)非N-糖基化蛋白的方法 |
| 主分類號 | C12N15/09(2006.01)I |
| 分類號 | C12N15/09(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N15/52(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 山東大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 祁慶生;蘇移山;王 鵬 |
| 地址 | 250100山東省濟(jì)南市山大南路27號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 濟(jì)南圣達(dá)專利商標(biāo)事務(wù)所 |
| 代理人 | 鄭華清 |
| 國省代碼 | 山東;37 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種利用酵母生產(chǎn)非N-糖基化蛋白的方法，由下述步驟組成 (1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建： 克隆出N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC3.5.1.52)基因，經(jīng)酶切后插入大腸桿菌載體，命名為vector-PNG；然后克隆出酵母性凝集因子C-末端錨定位點(diǎn)基因，經(jīng)酶切后插入到vector-PNG載體；與N-糖酰胺酶基因形成融合基因，載體命名為vector-PNG-A；vector-PNG-A載體經(jīng)EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入經(jīng)相同酶切的酵母表達(dá)載體，獲得了帶有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重組載體命名為pPIC9k--PNG-A； (2)重組酵母菌株的構(gòu)建： 用SalI將重組載體pPIC9k-PNG-A線性化；電轉(zhuǎn)到酵母菌株基因組中，構(gòu)建重組酵母菌株；在MD平板上長出的菌落為陽性克隆； 其中，MD平板培養(yǎng)基配方為：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖； (3)分泌糖蛋白的重組菌株的構(gòu)建： 將糖蛋白基因插入到pPIC9K載體的α-factor信號肽下游的多克隆位點(diǎn)，獲得了含有糖蛋白基因分泌表達(dá)載體；用SacI將含有該糖蛋白基因的pPIC9K載體線性化，利用電轉(zhuǎn)化的方法將線性化的重組載體，轉(zhuǎn)化到上述構(gòu)建的表面表達(dá)N-糖酰胺酶的重組酵母菌株基因組中，構(gòu)建成分泌表達(dá)目的蛋白的酵母重組工程菌株；通過G418抗生素篩選出陽性克隆菌株； (4)糖蛋白在酵母中誘導(dǎo)表達(dá)： 將上述陽性克隆工程菌株，接種于YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12-24小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分；當(dāng)發(fā)酵液濃度達(dá)OD＝5-6時(shí)，按體積比1∶100的接種量轉(zhuǎn)接到BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)28～35小時(shí)；5000g離心5～10分鐘，收集菌體，用PBS洗滌菌體1～2次，轉(zhuǎn)接到BMM液體培養(yǎng)基中，使發(fā)酵液濃度達(dá)OD＝0.5-1.0時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)溫度20℃-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180-250轉(zhuǎn)/分，每隔12小時(shí)向培養(yǎng)基中加入5～10ml/L量的甲醇，誘導(dǎo)溫度20℃-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180-250轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)36-60小時(shí)；將N-糖酰胺酶表達(dá)于酵母細(xì)胞壁表面，同時(shí)外源糖蛋白分泌表達(dá)到培養(yǎng)介質(zhì)中；在培養(yǎng)介質(zhì)中，表面表達(dá)的N-糖酰胺酶將分泌表達(dá)的糖蛋白的糖鏈切除，生成了非N-糖基化蛋白； 其中PBS為：pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液； 其中YPD培養(yǎng)基配方為：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖； 其中BMG培養(yǎng)基配方為：pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L； 其中BMM液體培養(yǎng)基配方為：pH6.0，100mM磷酸鹽緩沖液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L； 其中，上述重組陽性克隆工程菌株可以通過離心、過濾去除。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開了一種利用酵母生產(chǎn)非N-糖基化蛋白的方法，即利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建含有N-糖酰胺酶和目的蛋白基因的表達(dá)載體，并通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母菌中，N-糖酰胺酶穩(wěn)定表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，目的蛋白經(jīng)分泌表達(dá)到培養(yǎng)介質(zhì)中，在分泌和培養(yǎng)過程中，表面表達(dá)的N-糖酰胺酶將分泌表達(dá)的目的糖蛋白的糖鏈除去，從而獲得經(jīng)過真核表達(dá)系統(tǒng)分泌的非N-糖基化蛋白。利用本發(fā)明的方法獲得的蛋白經(jīng)過真核蛋白的后處理加工，具有正確的構(gòu)像和三級結(jié)構(gòu)，但不具有酵母蛋白的N-糖基化，若作為蛋白藥物不會(huì)在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫源性；也不會(huì)因?yàn)檫^糖基化使表達(dá)蛋白失去活性。 |
| 國際公布 |
