體外培育牛黃－膽酸的測(cè)定－薄層掃描法

本方法采用薄層掃描法測(cè)定體外培育牛黃中膽酸的含量。

本方法適用于�？苿�(dòng)物牛Bos Taurus domesticus Gmelin的新鮮膽汁作母液，加入去氧膽酸、膽酸、復(fù)合膽紅素鈣等制成的體外培育牛黃的測(cè)定。

供試品加甲醇超聲提取，放冷，補(bǔ)重，搖勻，濾過，續(xù)濾液加20%氫氧化鈉溶液加熱回流，調(diào)pH值至酸性，用乙酸乙酯提取，提取液蒸干，殘?jiān)�加甲醇溶解，制成供試液，點(diǎn)樣、展開，以30%硫酸乙醇溶液顯色，用薄層掃描儀進(jìn)行掃描，于波長(zhǎng)λs=380nm，λ_R=650nm測(cè)量膽酸（C₂₄H₄₀O₅)吸收度積分值，計(jì)算其含量。

1. 乙酸乙酯

2 .20%氫氧化鈉溶液

3 .甲醇

4 .30％硫酸乙醇溶液

1 儀器

1.1薄層掃描儀

1.2涂布器

應(yīng)能使吸附劑在玻璃板上手工或自動(dòng)涂成一層符合厚度要求的均勻薄層。

1.3點(diǎn)樣器

一般采用微升毛細(xì)管或與之相應(yīng)的點(diǎn)樣器材。

1.4展開室

可用適合薄層板大小的專用玻璃缸，底部平底或雙槽，蓋子須密閉。

2 材料

2.1玻板

用10cm×10cm、10cm×15cm、20cm×10cm或20cm×20cm的規(guī)格，要求光滑、平整，洗凈后不附水珠，晾干。

2.2吸附劑

硅膠G，其顆粒大小一般要求直徑為10～40μm。

1. 對(duì)照品溶液的制備

取在105℃干燥至恒重的膽酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含0.48mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2. 供試品溶液的制備

取本品細(xì)粉0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘?jiān)��?0%氫氧化鈉溶液10mL，加熱回流2小時(shí)，冷卻，加稀鹽酸19mL調(diào)節(jié)pH值至酸性，用乙酸乙酯提取4次（25mL，25mL，20mL，20mL)，提取液均用同一鋪有少量無水硫酸鈉的脫脂棉濾過，濾液合并，回收溶劑，殘?jiān)�用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

注：“精密稱取”系指稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所稱取重量的千分之一�！熬�密量取”系指量取體積的準(zhǔn)確度應(yīng)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)該體積移液管的精度要求。

1. 薄層板制備

將吸附劑1份和水3份在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的氣泡后，倒入涂布器中，在玻板上平穩(wěn)地移動(dòng)涂布器進(jìn)行涂布（厚度為0.25～0.5mm)取下涂好薄層的玻板，于室溫下，置水平臺(tái)上晾干，在反射光及透射光下檢視，表面應(yīng)均勻，平整，無麻點(diǎn)、無氣泡、無破損及污染，于110℃烘30分鐘，冷卻后立即使用或置干燥箱中備用，或用商品預(yù)制板。

2. 點(diǎn)樣

精密吸取供試品溶液 2μL、對(duì)照品溶液 1μL與 3μL，分別交叉點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，如用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣到薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊1.0～1.5cm，樣點(diǎn)直徑一般不大于2mm，點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。

3. 展開

將點(diǎn)好樣品的薄層板放入展開缸的展開劑中，以異辛烷一乙酸丁酯一冰醋酸一甲酸（8：4：2：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以30%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰，取出。

4. 含量測(cè)定

在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用膠布固定，選擇反射方式，采用吸收法，進(jìn)行掃描，波長(zhǎng)：λs=380nm，λ_R=650nm，測(cè)量供試品吸收度積分值與對(duì)照品吸收度積分值，計(jì)算。

用外標(biāo)法測(cè)定時(shí)，若對(duì)照品各數(shù)據(jù)點(diǎn)在校正曲線上呈一通過原點(diǎn)的直線時(shí)，可用一點(diǎn)法校正，如不通過原點(diǎn)通常宜采用二點(diǎn)法校正，必要時(shí)用多點(diǎn)法校正。

中華人民共和國(guó)藥典，國(guó)家藥典委員會(huì)編、化學(xué)工業(yè)出版社，2005年版，一部p.120。