醫(yī)學免費論文:鼻息肉及下鼻甲黏膜成纖維細胞中組胺受體的表達

組胺不僅在細胞及組織內(nèi)發(fā)揮各種生理作用，而且可引起變應性鼻炎.組胺的各種作用是通過與細胞表面的組胺受體結(jié)合實現(xiàn)的，到目前為止所了解的組胺受體共有4種，分別為1,2,3,4型［1��2］.不同亞型的組胺受體起著不同的G�猜�(lián)結(jié)蛋白質(zhì)受體的功能,其中人1型組胺受體基因位于3p25染色體上，在胎盤中可見較多的表達，在肺、骨骼肌、心臟及腦組織中可見少量的表達［3��4］.2型組胺受體基因位于13號染色體上，在胃中有較強的表達，亦表達于腦組織及心臟［5］.胃壁細胞2型組胺受體被刺激時，可促進胃酸的分泌.3型組胺受體位于20號染色體上，可在丘腦的各個部位內(nèi)選擇性地表達［6］，并表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及末梢神經(jīng)系統(tǒng)，對神經(jīng)起調(diào)節(jié)作用［7］.4型組胺受體基因位于18q11染色體上，多表達于骨髓及脾臟，亦表達于末梢血液、胸腺、小腸及結(jié)腸［8��9］.目前認為4型組胺受體可能是Gi結(jié)合型受體，對免疫功能的影響及作用機制尚不十分清楚.成纖維細胞在人體中維持組織的結(jié)構(gòu)，分泌各種化學趨化因子如IL��8，CM�睠SF，eotaxin，IL��1,IL��6等［10��14］.上述現(xiàn)象提示，鼻息肉組織成纖維細胞中可能存在組胺受體，而其在鼻息肉的生成及發(fā)育過程中可能起著重要的作用.本研究旨在探討鼻息肉組織成纖維細胞中組胺受體及其亞型的存在與否，觀察鼻息肉組織中組胺受體蛋白的表達程度.

1  對象及方法

1.1  對象  選擇鼻息肉患者5例為研究對象，并將同側(cè)的下鼻甲黏膜為對照組.所有患者均有鼻涕及鼻塞等鼻部癥狀，MAST檢查呈陰性，AST及NPT檢查亦呈陰性，排除合并變應性鼻炎；所有患者均無吸煙史及其他疾病.術前2周內(nèi)禁用激素、抗生素及抗組胺類藥物.

1.2  方法

1.2.1  細胞培養(yǎng)  行功能性鼻內(nèi)窺鏡手術，切除鼻息肉及部分下鼻甲黏膜，行組織細胞培養(yǎng).成纖維細胞培養(yǎng)：用含有500U/mL青霉素,500mg/L鏈霉素,6mg/L fungizon(GIBCO,美國)的PBS洗滌3次，將下鼻甲黏膜切成1mm3大小，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫下放置5min，使之黏附，再添加含有100g/L FBS的Dulbeco’s Modified Eagle’s medium(DMEM, GIBCO,美國)培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，當形成單層成纖維細胞后除去培養(yǎng)液，用PBS洗滌，添加0.5g/L胰蛋白酶�睧DTA，置于37℃，50mL/L二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)處理5min，使細胞分離，用含有20g/L FBS及抗生素的DMEM培養(yǎng)液浮游細胞，進行隔代培養(yǎng)（圖1).將培養(yǎng)的成纖維細胞分別灌注到6孔培養(yǎng)皿中，每孔細胞數(shù)為3×105個，本實驗中應用的是2代培養(yǎng)的纖維母細胞.

圖1  培養(yǎng)完成后的鼻黏膜成纖維細胞

1.2.2  RT�睵CR  RNA的分離依照RNA�睟ee溶液的分離方法(Tel�瞭est,Inc,Friendswood,美國)進行.在直徑為60mm培養(yǎng)皿里放入1mmol/L RNA�睟ee溶液進行溶解，添加0.2倍的氯仿使之混合后置于冰塊上，5min后用離心機（Centrifuge 5402,Eppendrof,德國)于12000r/min，4℃離心15min，取上清液，加入同等量的isopropanol，在室溫條件下沉淀10min，隨后以12000r/min，4℃離心5min，棄去上清液，向沉淀物中加入750mL/L乙醇0.8mL，以7500r/min，4℃離心5min，置于空氣內(nèi)10min，使沉淀物在空氣中干燥后分離出ＲＮＡ，將其用ＤＥＰＣ處理過的蒸餾水溶解.采用熒光分光光度計(Ultraspec 2000,Parmacia Biotech,Cambridge,英國)于波長為260nm及280nm處測定ＲＮＡ值，Ａ２６０／Ａ２８０比值為１.５～１.８，將ＲＮＡ置于-70℃保存.為進行酵素聚合連鎖反應需合成相補的ＤＮＡ（cDNA).將１μg ＲＮＡ調(diào)節(jié)到用ＤＥＰＣ處理過的蒸餾水１０μL中，７０℃加熱５min，于冰塊上放置5min.加入２μL的１０×緩沖劑(0.1mol/L Tris�阐}酸, pH值為9.0,0.5mol/L氯化鉀,10g/L Trition X��100),取4μL 25mmol/L氯化鎂， 2μL 10mmol/L dNTP,0.5μL(40U/μL)RNase抑制物,加入15U ＡＭＶ反向transcriptase(Promega,Medison,WI,美國)后將總劑量調(diào)整至２０μL.反應條件為４２℃ １h，９５℃ ５min，４℃ ５min.PCR反應如下:在２μL cDAN中加入５μL的１０×ＰＣＲ buffer(100mmol/L Tris�阐}酸, pH值為8.3, 0.5mol/L氯化鉀,15mmol/L氯化鎂),4μL的2.5mmol/L dNTP,20pmol上游及下游引物，２U Ｔaq DNA聚合酶(TAKARA,日本)，滅菌蒸餾水調(diào)整至50μL.利用遺傳因子增幅器（Biometra, Gottingen,德國)進行擴增，具體的條件為組胺受體（HR1，HR2，HR3，HR4與β�瞐ctin)初期變性95℃ 5min，95℃ 1min,55℃ 1min，72℃延長1min，共30個周期（β�瞐ctin是25周期)，最后的延長是72℃10min.10μL PCR生成物內(nèi)混合加入2μL的6×載入緩沖液(2.5g/L溴酚藍,2.5g/L二甲苯藍,300g/L蔗糖)，再添加0.5mg/L溴化乙錠，于含0.5×TBE(45mmol/L Tris�瞓orate, 1mmol/L EDTA)的20g/L瓊脂糖凝膠中，以90V電壓下電泳1h，利用Gel Doc 1000凝膠成象系統(tǒng)（Bio�睷ad, Hercules,CA,美國)觀察條帶.1型及2型組胺受體的陽性對照選擇鼻黏膜的上皮細胞，3型及4型的選擇人末梢血液白細胞.Real�瞭ime PCR：向1.5mL實驗管內(nèi)加入25mmol/L氯化鎂2.4μL,2μL含Lightcycler fast start enzyme的DNA master SYBR green Ⅰ, 10pmol上游及下游引物，以蒸餾水調(diào)節(jié)為１８μL，向１８μL混合物中加入２μL cDNA后，分別灌注到離心管內(nèi)，于７００r/min條件下離心５min，移至Lightcycler增幅器（Roche Applied Science, Mannheim,美國).１型及２型組胺受體β�瞐ctin的退火溫度為５５℃，根據(jù)ＰＣＲ生成物的大小將速度調(diào)節(jié)為２５bp/s進行實時擴增醫(yī).學.全.在.線jfsoft.net.cn.

1.2.3  流式細胞儀檢測  用ＰＢＳ將已形成單層的成纖維細胞洗滌2次，37℃條件下用0.5g/L胰蛋白酶�睧DTA處理5min，向細胞內(nèi)添加100g/L  FBS，收集細胞，以12000r/min，４℃離心５min，用冷PBS洗滌細胞沉淀物２次，添加１型及２型組胺受體的1次抗體（Chemicon,Temecula,CA,美國)稀釋２０倍，在４℃條件下反應１h，待反應結(jié)束后用冷PBS洗滌２次，用異硫氰酸熒光素結(jié)合抗體(Chemicon, Temecula,CA,美國)稀釋5000倍后，于４℃條件下反應1h，用冷PBS洗滌２次，利用ＦＡＣＳ進行測定.在無刺激條件下培養(yǎng)２４h，測定１型及２型組胺受體蛋白.

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