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實(shí)驗(yàn)十七 肝糖原的提取與鑒定 |
| 【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p> 掌握動(dòng)物組織細(xì)胞糖原的提取原理；熟悉肝糖原提取的實(shí)驗(yàn)過程；掌握糖原的鑒定方法。 【實(shí)驗(yàn)原理】 肝和肌肉組織中糖原的含量最高，因此適于作糖原的提取與鑒定。 用三氯乙酸破壞肝組織的酶且沉淀蛋白而保留糖原。糖原不溶于乙醇而溶于熱水，故先用95%乙醇將濾液中的糖原沉淀，再溶于熱水。 糖原溶液呈乳樣光澤，遇碘呈紅棕色，本身無還原性，在酸性溶液中加熱可水解為具有還原性的葡萄糖。后者可將堿性銅溶液（班氏試劑，Benedict reagent)中的二價(jià)銅氧化成氧化亞銅。利用上述性質(zhì)，可判定組織中糖原的存在。 【實(shí)驗(yàn)試劑和器材】 1．試劑 ⑴ 5%三氯乙酸（acetocaustin)。 ⑵ 95%乙醇。 ⑶ 0.9%NaCl。 ⑷ 碘試劑：I2（iodine)100 mg，KI（potassium iodide)200 mg，溶解于30 mL蒸餾水。 ⑸ 濃HCl。 ⑹ 50%NaOH。 ⑺ 班氏試劑（Benedict reagent)：取檸檬酸鈉（sodium citrate)173 g及無水Na2CO3（sodium carbonate)100 g放入2000 mL醫(yī)學(xué).全在線jfsoft.net.cn燒杯內(nèi)，加水約700 mL，加熱溶解并以玻棒不斷攪和，溶解后待冷卻至室溫。另用200 mL燒杯，稱入CuSO4·5H2O（cupric sulfate)17.3 g，加蒸餾水100 mL，加熱溶解。將CuSO4液緩慢倒入前液，不斷攪和。補(bǔ)足水量至1000 mL。若試劑混濁，可用脫脂棉過濾入瓶備用。 2．器材 ⑴ 剪刀、漏斗、濾紙、滴管。 ⑵ 天平、酒精燈、水浴鍋。 ⑶ 研缽、白瓷板。 ⑷ 電動(dòng)離心機(jī)。 【實(shí)驗(yàn)步驟】 1．糖原的提取 ⑴ 迅速處死動(dòng)物，立即取出肝，稱取肝組織1~2 g。 ⑵ 將肝組織放入研缽中，用剪刀盡量剪碎；加入5%三氯乙酸2 mL，將肝組織研磨至糜狀；再按5 mL/g肝組織補(bǔ)加5%三氯乙酸�；靹�，用濾紙過濾。 ⑶ 取濾液3 mL于塑料離心管中，加入95%乙醇3 mL，加蓋后混勻，靜置10分鐘，以3000rpm離心5分鐘，傾去上清液，白色沉淀即為糖原。 2．糖原的鑒定 ⑴ 加蒸餾水2 mL于上述離心管中，用玻棒或吸管將沉淀攪起，轉(zhuǎn)入玻璃試管中。 ⑵ 將試管置沸水浴中加熱使沉淀完全溶解，對(duì)光觀察溶液，可見乳樣光澤，記錄。 ⑶ 取試管1支，加班氏試劑2 mL，在酒精燈上加熱至沸騰；再加入上述糖原溶液5滴，混勻后再在火焰上煮沸1分鐘左右，jfsoft.net.cn/wsj/冷卻后觀察顏色并作記錄。 ⑷ 取糖原溶液2滴于白瓷比色盤中，加碘試劑1滴，觀察并記錄其顏色。 ⑸ 在上述剩余的糖原溶液中，加入濃鹽酸10滴，置于沸水浴水解20分鐘，取出冷卻后加50%NaOH 5滴中和。 ⑹ 另取試管1支，加班氏試劑2 mL，于火焰上加熱至沸騰；再加入糖原水解液6~8滴，輕搖混勻，在火焰上直接加熱1分鐘左右，冷卻觀察并記錄結(jié)果。 【實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)】 1. 采用頸動(dòng)脈放血處死兔子，且動(dòng)作要迅速，以免肝組織淤血。 2. 盡量將肝組織研磨至糜狀以釋放所有的糖原分子。 3. 糖原水解液加加班氏試劑鑒定時(shí)，一定要先加班氏試劑于火焰上加熱至沸騰觀察有無顏色變化，即檢驗(yàn)加班氏試劑是否本身已被還原。 4. 糖原水解液加加班氏試劑鑒定時(shí)，盡量在火焰加熱久一點(diǎn)，直到觀察到顏色變化。 【思考題】 1. 糖原水解液與糖原溶液有何實(shí)質(zhì)區(qū)別？ 2. 為什么要取肝組織進(jìn)行提取糖原？其它組織是否都能提取糖原？
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