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藥學(xué)的生物化學(xué)-教材建設(shè):核酸的化學(xué)

藥學(xué)的生物化學(xué):教材建設(shè) 核酸的化學(xué):第四章 核酸的化學(xué)第一節(jié) 核酸的概念和化學(xué)組成核酸(nucleic acid)是含有磷酸基團(tuán)的重要生物大分子,因最初從細(xì)胞核分離獲得,又具有酸性,故稱為核酸。一切生物都含有核酸,即使比細(xì)菌還小的病毒也含有核酸。所以凡是有生命的地方就有核酸存在。核酸具有非常重要的生物學(xué)意義,不僅與正常生命活動如生長繁殖、遺傳變異、細(xì)胞分化等有著密切關(guān)系,而且與生命的異;顒尤缒[瘤發(fā)生、輻射損傷、遺傳病、代謝病、病毒

第四章  核酸的化學(xué)

第一節(jié)  核酸的概念和化學(xué)組成

核酸(nucleic acid)是含有磷酸基團(tuán)的重要生物大分子,因最初從細(xì)胞核分離獲得,又具有酸性,故稱為核酸。一切生物都含有核酸,即使比細(xì)菌還小的病毒也含有核酸。所以凡是有生命的地方就有核酸存在。

核酸具有非常重要的生物學(xué)意義,不僅與正常生命活動如生長繁殖、遺傳變異、細(xì)胞分化等有著密切關(guān)系,而且與生命的異;顒尤缒[瘤發(fā)生、輻射損傷、遺傳病、代謝病、病毒感染等也息息相關(guān)。因此核酸研究是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)與醫(yī)藥學(xué)發(fā)展的重要領(lǐng)域。

一、 核酸的概念和重要性

核酸在細(xì)胞內(nèi)通常以與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白的形式存在。天然的核酸分為兩大類,即核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。DNA主要分布在細(xì)胞核中,RNA可存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。DNA是生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)。RNA在細(xì)胞中的含量比DNA高。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞都含有三種主要RNA:信使RNA(mRNA),核蛋白體RNA(rRNA)和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)。真核細(xì)胞還含有核不均RNA(HnRNA)和核小RNA(SnRNA)。HnRNA是mRNA的前體物,SnRNA參與RNA的修飾加工和對細(xì)胞與基因行為的調(diào)控,是一類新的核酸調(diào)控分子。

(一) 核酸是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)

遺傳與變異是最重要、最本質(zhì)的生命現(xiàn)象。遺傳是相對的,有了遺傳的特征才保持物種的相對穩(wěn)定性。變異是絕對的,有變異才有物種的進(jìn)化和生物發(fā)展的可能。生物遺傳特征的延續(xù)與生物進(jìn)化都是由基因所決定的;蛱卣魇怯蒁NA分子中的特定核苷酸種類、數(shù)目和排列順序所決定的,一個基因(gene)系指含有合成一個功能性生物分子(蛋白質(zhì)或RNA)所需信息的一個特定DNA片段,所以說核酸是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)。利用DNA人工重組技術(shù),可以使一種生物的DNA或片段(基因)引入另一種生物體內(nèi),而后者則能表現(xiàn)前者的生物性狀,從而實現(xiàn)了超越生物種間的基因轉(zhuǎn)移,并表現(xiàn)出被轉(zhuǎn)移基因的生物學(xué)功能。

(二) 核酸與生物遺傳信息的傳遞

生物遺傳信息貯存在DNA分子上,但生物性狀并不由DNA直接表現(xiàn),而是通過各種蛋白質(zhì)的生物功能才表現(xiàn)出來。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是由DNA決定的,也就是說遺傳信息是由DNA傳向蛋白質(zhì)的。遺傳信息的這種傳遞不是直接的,而是通過中間信使,即DNA的副本mRNA來傳遞的,即DNA把自己的信息先傳給mRNA,然后再由mRNA傳給蛋白質(zhì)。所以蛋白質(zhì)的生物合成和生物性狀的表現(xiàn)(如新陳代謝、生長發(fā)育、組織分化等)都直接與核酸緊密相關(guān)。

(三) 核酸與醫(yī)藥

由于DNA是遺傳信息的載體,因此,DNA分子結(jié)構(gòu)的改變,必將導(dǎo)致生物功能的改變。如病毒的致病作用,惡性腫瘤、放射病及遺傳性疾病、代謝病、輻射損傷等都與核酸功能的變化密切相關(guān)。病毒主要是由蛋白質(zhì)和核酸組成的,因此核酸類衍生物可作為抗病毒藥物,如5-碘尿苷(5-碘脫氧嘧啶核苷)、阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)、阿糖腺苷(腺嘌呤阿拉伯糖苷)等。還有多種雙股多聚核苷酸,如多聚肌苷酸;多聚胞苷酸(poly Ⅰ:C),可誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生干擾素,保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染,具有防治病毒性疾病的療效。

許多抗癌藥物屬于核苷或核酸類衍生物,如治療消化道癌癥5-氟尿嘧啶,治療白血病的6-巰基嘌呤等?拱┖涂共《舅幬锏淖饔檬且种撇≡怂崤c蛋白質(zhì)的合成,從而抑制了癌細(xì)胞與病毒的進(jìn)一步增殖,因此抗癌、抗病毒藥物的作用機(jī)制與新藥合成研究都與核酸化學(xué)關(guān)系密切。

基因工程技術(shù)正在改變醫(yī)藥工業(yè)的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式,已有許多基因工程藥物研究成功并投入臨床應(yīng)用,如人胰島素、人生長素、α-干擾素、乙肝疫苗、人白介素-2等,這不僅滿足了醫(yī)療需要,而且將對醫(yī)藥產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的更新?lián)Q代產(chǎn)生重大影響。另外,應(yīng)用基因技術(shù),還可能把遺傳病病人所缺乏的基因?qū)нM(jìn)體內(nèi),使其體細(xì)胞重新具有所缺陷的基因,表達(dá)所需要的蛋白進(jìn)行基因治療。

應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物,將成為未來生物藥物的一種新生產(chǎn)手段。因此核酸的研究與應(yīng)用對醫(yī)療衛(wèi)生和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)極為重要,是戰(zhàn)勝疾病、開發(fā)新藥、創(chuàng)造新物種與新品種的有效手段。

二、 核酸的基本結(jié)構(gòu)單位——單核苷酸

核酸是一種多核苷酸(Polynucleotide),它的基本結(jié)構(gòu)單位是單核苷酸(mononucleotide)。核苷酸還可以進(jìn)一步分解成核苷(nucleoside)和磷酸。核苷再進(jìn)一步分解成堿基(base)(嘌呤堿與嘧啶堿)和戊糖(pentose)。戊糖有兩種:D-核糖(D-ribose)和D-2-脫氧核糖(D-2-deoxyribose),據(jù)此將核酸分為核糖核酸和脫氧核糖核酸。

RNA主要由腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶四種堿基組成的核糖核苷酸構(gòu)成。DNA主要由腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶四種堿基組成的脫氧核糖核苷酸組成。RNA和DNA分子中三種堿基是相同的,只有一種堿基不同,RNA分子中是尿嘧啶,而DNA分子中是胸腺嘧啶。RNA和DNA的基本化學(xué)組成見表4-1。

表4-1  DNA和RNA的基本化學(xué)組成

DNA

RNA

嘌呤堿(purine bases)

腺嘌呤(adenine)

腺嘌呤

鳥嘌呤(guanine)

鳥嘌呤

嘧啶堿(pyrimidine bases)

胞嘧啶(cytosine)

胞嘧啶

胸腺嘧啶(thymine)

尿嘧啶(uracil)

戊糖(pentose)

D-2-脫氧核糖

D-核糖

磷酸

磷酸

*粗黑體字示DNA和RNA基本化學(xué)組成的不同處。

(一) 核苷和核苷酸

1. 堿基 核酸中的堿基分兩類:嘧啶堿和嘌呤堿。

(1)嘧啶堿:核酸中常見的嘧啶堿有三類:胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。DNA和RNA中都含有胞嘧啶,RNA還含有尿嘧啶,DNA還含有胸腺嘧啶。此外,小麥胚DNA含有5-甲基胸嘧啶,某些噬菌體中含有5-羥甲基胞嘧啶和5-羥甲基尿嘧啶等。

嘧啶 胞嘧啶 尿嘧啶胸腺嘧啶

5-甲基胞嘧啶5-羥甲基胞嘧啶  5-羥甲基尿嘧啶

(2)嘌呤堿:核酸中所含的嘌呤堿主要有腺嘌呤和鳥嘌呤。

嘌呤 腺嘌呤  鳥嘌呤

 (3)稀有堿基:除表4-1所列核酸中五種基本的堿基外,核酸中還有一些含量甚少的堿基,稱為稀有堿基。很多稀有堿基是甲基化堿基。如1-甲基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基次黃嘌呤和次黃嘌呤、二氫尿嘧啶等。

1-甲基腺嘌呤 1-甲基鳥嘌呤

(1-methyladenine) (1-methylquanine)

次黃嘌呤 1-甲基次黃嘌呤  二氫尿嘧啶

(hypoxanthine)  (1-methylhypoxanthine)  (dihydrouracil)

2. 核糖和脫氧核糖 RNA和DNA兩類核酸是因所含戊糖不同而分類的。RNA含β-D-核糖,DNA含β-D-2脫氧核糖。某些RNA中含有少量β-D-2-O-甲基核糖。核酸分子中的戊糖都是β-D-型。

β-D-核糖 β-D-2-脫氧核糖β-D-2-O-甲基核糖

3. 核苷 戊糖和堿基縮合而成的糖苷稱為核苷(nucleoside)。戊糖和堿基之間的連接是戊糖的第一位碳原子(C1)與嘧啶堿的第一位氮原子(N1)或嘌呤堿的第九位氮原子(N9)相連接。戊糖和堿基之間的連接鍵是N—C鍵,一般稱為N-糖苷鍵。

核苷中的D-核糖和D-2-脫氧核糖都是呋喃型環(huán)狀結(jié)構(gòu)。糖環(huán)中的C1是不對稱碳原子,所以有α和β兩種構(gòu)型。核酸分子中的糖苷鍵均為β-糖苷鍵。

應(yīng)用X-射線衍射法證明,核苷中的堿基與糖環(huán)平面互相垂直。

根據(jù)核苷中所含戊糖不同,將核苷分為核糖核苷和脫氧核糖苷兩類。

在核苷的編號中,糖的編號數(shù)字上加一撇,以便與堿基編號區(qū)別。對核苷進(jìn)行命名時,先冠以堿基的名稱,如腺嘌呤核苷、胸腺嘧啶脫氧核苷等。

RNA中主要的核糖核苷有四種:腺嘌呤核苷(adenosine,A)、鳥嘌呤核苷(guanosine,G)、胞嘧啶核苷(cytidine,C)和尿嘧啶核苷(uridine,U)。其結(jié)構(gòu)式如下:

腺嘌呤核苷鳥嘌呤核苷胞嘧啶核苷  尿嘧啶核苷

(腺苷)        (鳥苷)   (胞苷) (尿苷)

DNA中主要的脫氧核糖核苷也有四種:腺嘌呤脫氧核苷(deoxyadenosine,dA)、鳥嘌呤脫氧核苷(deoxyguanosine,dG)、胞嘧啶脫氧核苷(deoxycytidine,dC)、胸腺嘧啶脫氧核苷(deoxythymidine,dT)。其結(jié)構(gòu)式如下:

腺嘌呤脫氧核苷  鳥嘌呤脫氧核苷 胞嘧啶脫氧核苷  尿嘧啶脫氧核苷

(脫氧腺苷)       (脫氧鳥苷)  (脫氧胞苷)      (脫氧胸苷)

tRNA中含有少量假尿嘧啶核苷(pseudouridine),其結(jié)構(gòu)特殊,它的核糖不是與尿嘧啶的N1相連接,而是與嘧啶環(huán)的C5相連接,結(jié)構(gòu)式如下:

假尿嘧啶核苷

4. 核苷酸 核苷中戊糖的羥基磷酸酯化,就形成核苷酸(nucleotide)。即核苷酸是核苷的磷酸酯。根據(jù)核苷酸中的戊糖不同,核苷酸可分為兩大類:核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。核苷酸是構(gòu)成核酸分子的基本結(jié)構(gòu)單位。由于核糖中有三個游離的羥基(2",3"和5"),因此核糖核苷酸有2"-核苷酸、3"-核苷酸和5"-核苷酸三種。而脫氧核糖只有3"和5"兩個游離羥基可被酯化,因此只有3"-脫氧核苷酸和5"-脫氧核苷酸兩種。自然界存在的游離核苷酸為5"-核苷酸,一般其代號可略去5"。

5’-腺嘌呤核苷酸  3’-腺嘌呤核苷酸

(5’-AMP)(3’-AMP)

5’-胞嘧啶脫氧核苷酸 3’-胞嘧啶脫氧核苷酸

(5’-dCMP)(3’-dCMP)

表4-2  RNA和DNA的基本結(jié)構(gòu)單位

RNA的基本結(jié)構(gòu)單位

DNA的基本結(jié)構(gòu)單位

腺嘌呤核苷酸

(adenosine monophosphate,AMP)

腺嘌呤脫氧核苷酸

(deoxyadenosine monophosphate,dAMP)

鳥嘌呤核苷酸

(guanosine monophosphate,GMP)

鳥嘌呤脫氧核苷酸

(deoxyguanosine monophosphate,dGMP)

胞嘧啶核苷酸

(cytidine monophosphate,CMP)

胞嘧啶脫氧苷酸

(deoxycytidine monophosphate,dCMP)

尿嘧啶核苷酸

(uridine monophosphate,UMP)

胸腺嘧啶脫氧核苷酸

(deoxythymidine monophosphate,dTMP)

核酸(RNA和DNA)是由許多核苷酸分子以3",5"-磷酸二酯鍵互相連接而組成的多核苷酸。RNA和DNA的基本結(jié)構(gòu)單位如表4-2。

(二) 環(huán)化核苷酸

環(huán)化核苷酸如環(huán)化腺苷酸和環(huán)化鳥苷酸普遍存在于動植物和微生物細(xì)胞中。它們的結(jié)構(gòu)式如下:

3",5"-環(huán)腺苷酸 3",5"-環(huán)鳥苷酸

3",5"-環(huán)腺苷酸(3,5-cyclicadenylic acid)或稱環(huán)腺-磷(cAMP)。3",5"-環(huán)鳥苷酸(3,5-cyclic guanylic acid)或稱環(huán)鳥-磷(cGMP)。

環(huán)化核苷酸參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生理生化過程,控制生物的生長、分化和細(xì)胞對激素的效應(yīng)。cAMP和cGMP分別具有放大激素作用信號和縮小激素作用信號的功能,因此稱為激素的第二信使。cAMP還參與大腸桿菌中DNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控。

外源cAMP不易通過細(xì)胞膜,cAMP的衍生物雙丁酰cAMP可通過細(xì)胞膜,已應(yīng)用于臨床,對心絞痛心肌梗塞癥等有一定療效。

(三)輔酶類核苷酸

許多輔酶是核苷酸類衍生物,簡述如下:

1. 輔酶Ⅰ(CoⅠ,NAD)和輔酶Ⅱ(CoⅡ,NADP)  輔酶Ⅰ(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)和輔酶Ⅱ(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)都是二核苷酸,即由兩個單核苷酸組成,一個單核苷酸含有的堿基是腺嘌呤,另一個核苷酸的堿基是尼克酰胺(維生素PP)。其組成簡示如下:

輔酶I(NAD) 輔酶II(NADP)

輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ都是脫氫酶的輔酶,其結(jié)構(gòu)中的尼克酰胺部分能可逆地加氫與脫氫,在生物氧化中起遞氫作用。

2. 黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)  FAD的組成簡示如下:

可見FAD是類似二核苷酸的化合物,其分子中一半是腺嘌呤核苷酸,另一半是磷酸核黃素,又稱黃素單核苷酸(FMN),其結(jié)構(gòu)式與核苷酸類似。FAD和FMN的主要功能是在生物氧化過程中起傳遞氫原子的作用。

3. 輔酶A(CoA,CoA-SH)  輔酶A是核苷酸衍生物,結(jié)構(gòu)中含有腺嘌呤核苷酸,其組成簡示如下:

輔酶A分子中的泛酸是一種水溶性維生素,而氨基乙硫醇(H2N—CH2—CH2—SH)結(jié)構(gòu)中的巰基(—SH)是輔酶A參與酶促反應(yīng)的一個重要基團(tuán),因此,輔酶A常用CoA-SH表示。

輔酶A參與糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝,尤其對脂肪代謝的促進(jìn)作用更加重要。輔酶A已應(yīng)用于冠狀動脈粥樣硬化的防治。

第二節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu)

一、DNA的分子結(jié)構(gòu)

(一) DNA的一級結(jié)構(gòu)

核酸是由許多分子單核苷酸構(gòu)成的。核酸的一級結(jié)構(gòu)是指構(gòu)成核酸的各個單核苷酸之間連接鍵的性質(zhì)以及組成中單核苷酸的數(shù)目和排列順序(堿基排列順序)。

實驗表明,核酸中核苷酸和核苷酸之間通過3",5"-磷酸二酯鍵連接。即它們的連接方式是:一個核苷酸的脫氧核糖的第5"位碳原子(C5")上的磷酸基與相鄰的核苷酸的脫氧核糖的第3"位碳原子(C3")上的羥基結(jié)合。后者分子中的C5上的磷酸基又可與另一個核苷酸分子C3"上的羥基結(jié)合。如此通過3",5"-磷酸二酯鍵將許多核苷酸連接在一起,形成多核苷酸鏈。DNA是由數(shù)量極其龐大的四種脫氧核糖核苷酸,通過3",5"-磷酸二酯鍵彼此連接起來的直線形或環(huán)形分子,DNA沒有側(cè)鏈。圖4-1表示DNA多核苷鍵鏈的一個小片段。

圖4-1  DNA分子中多核苷酸鏈的一個小片段及縮寫符號

A:DNA多核苷酸鏈的一個小片段;B:為線條式縮寫;C:為文字式縮寫

圖4-1的右側(cè)是多核苷酸的兩種縮寫法。B為線條式縮寫,豎線表示核糖的碳鏈,A、C、T、G表示不同的堿基,P和斜線代表3",5"-磷酸二酯鍵。C為文字式縮寫,其中P表示磷酸基團(tuán),當(dāng)P寫在堿基符號左邊時,表示P在C5"上,而P寫在堿基符號右邊時,則表示P與C3"相連。有時多核苷酸中的磷酸二酯鍵的P也被省略,如寫成---pA-C-T-G…或pACTG。各種簡化式的讀向是從左到右,所表示的堿基序列是從5"到3"。

不同的DNA的核苷酸數(shù)目和排列順序不同,生物的遺傳信息就儲存記錄于DNA的核苷酸序列中。測定DNA的核苷酸序列,也即測定DNA的一級結(jié)構(gòu),近幾年來已取得重大突破,如大腸桿菌DNA、果蠅DNA、小鼠DNA和人類DNA等的一級結(jié)構(gòu)測序工作均已完成。

(二) 真核細(xì)胞染色質(zhì)DNA與原核生物DNA的一級結(jié)構(gòu)特點

真核細(xì)胞染色質(zhì)由DNA、組蛋白、非組蛋白和RNA組成。其中DNA分子量很大,它是遺傳信息的載體。與原核細(xì)胞染色質(zhì)DNA比較在一級結(jié)構(gòu)上真核細(xì)胞DNA具有以下顯著特點:

1. 重復(fù)順序 真核細(xì)胞染色質(zhì)DNA具有許多重復(fù)排列的核苷酸序列,稱為重復(fù)順序。按重復(fù)程度不同可分為高度重復(fù)順序,中度重復(fù)順序和單一順序三種。

(1)高度重復(fù)順序:許多真核細(xì)胞染色質(zhì)DNA都含有高度重復(fù)順序。這種重復(fù)順序結(jié)構(gòu)的“基礎(chǔ)順序”短,含5~100bp,重復(fù)次數(shù)可高達(dá)幾百萬次(106~107)。高度重復(fù)順序結(jié)構(gòu)中G—C含量高,進(jìn)行CsCl梯度離心時常在DNA主峰旁顯示一個或多個小峰,這些小峰稱為衛(wèi)星峰,這部分DNA又稱為衛(wèi)星DNA。這種DNA的GC含量一般少于主帶中的DNA。浮力密度也低。

(2)中度重復(fù)順序:這種結(jié)構(gòu)的“基礎(chǔ)順序”長,可達(dá)300bp,或更長,重復(fù)次數(shù)從幾百到幾千不等。組蛋白基因,rRNA基因(rDNA)及tRNA基因(tDNA)大多數(shù)為中度重復(fù)順序。

(3)單一順序:又稱單拷貝順序,真核細(xì)胞中,除組蛋白外,其他所有蛋白質(zhì)都是由DNA中單一序列決定的。每一序列片段決定一個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),為一個蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因。迄今為止,在真核生物中還沒有發(fā)現(xiàn)一個蛋白質(zhì)基因是多順反子結(jié)構(gòu)的。

2. 間隔順序與插入順序 在真核細(xì)胞DNA分子中,除了編碼蛋白質(zhì)和RNA的基因序列片段外,還有一些片段不編碼任何蛋白質(zhì)和RNA,它們可以存在于基因與基因之間,也可以存在于基因之內(nèi)。前者稱為間隔順序,后者稱為插入順序。在許多DNA分子中,常常含有長短不一的間隔順序,也常常出現(xiàn)一些插入順序?qū)⒁粋基因分成幾段,如雞卵清蛋白基因,珠蛋白基因都含有插入順序。通常把基因內(nèi)的插入順序稱為內(nèi)含子(intron),把編碼蛋白質(zhì)的基因順序稱為外顯子(exon)。

3. 回文結(jié)構(gòu) 在真核細(xì)胞DNA分子中,還存在許多特殊的序列。這種結(jié)構(gòu)中脫氧核苷酸的排列在DNA兩條鏈中的順讀與倒讀意義是一樣的(即脫氧核苷酸排列順序相同),脫氧核苷酸以一個假想的軸成為180°旋轉(zhuǎn)對稱(即使軸旋轉(zhuǎn)180°兩部分結(jié)構(gòu)完全重合),這種結(jié)構(gòu)稱為回文結(jié)構(gòu)。如下圖所示:

對稱軸

原核生物DNA順序組織具有以下不同特點:

1. 原核生物在DNA順序組織上的最大特點是基因重疊,如病毒DNA分子一般都不大,但又必須裝入相當(dāng)多的基因,因此可能在這種壓力下導(dǎo)致病毒DNA在進(jìn)化過程中重疊起來。也就是說在同一DNA序列中,常包括不同的基因區(qū),這些重疊在一起的基因,使用的編碼組序不同,因此雖然是同樣的DNA順序區(qū)段內(nèi),都可翻譯出不同的蛋白質(zhì)。如在噬菌體ΦX174中,基因B和基因K重疊在基因A之內(nèi)。由下圖可見在同一部分核苷酸順序片段中,它們在三個編碼組之中,含義各不相同。

由于基因的重疊,在重疊部位一個堿基的突變將影響二個或三個蛋白質(zhì)的表達(dá)。

2. 在原核生物的DNA順序組織中,每個轉(zhuǎn)錄的mRNA常常包含了多個順反子,而且功能上有關(guān)的順反子通常串聯(lián)在一個mRNA分子上。這些編碼在同一個mRNA分子中的多種功能蛋白在生理功能上都是密切相關(guān)的。這種DNA順序組織可能是原核基因協(xié)同表達(dá)的一種調(diào)控方式。如ΦX174噬菌體DNA序列,從啟動子PO開始轉(zhuǎn)錄的mRNA包含了基因D—(E)—J—F—G—H。其中基因J、F、G、H都是編碼噬菌體的外殼蛋白。因此原核生物DNA順序的另一個特點是功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄在同一個mRNA分子上。

3. 原核生物DNA順序所含有的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)的,一般不含有插入或間隔序列,而且在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的DNA順序的組織形式是多種多樣的,調(diào)控區(qū)的不同組織形式與不同的生物功能有明顯關(guān)系。

(三) DNA的二級結(jié)構(gòu)

1. DNA二級結(jié)構(gòu)的Watson-Crick模型 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型是Watson和Crick在前人的工作基礎(chǔ)上于1953年提出來的(圖4-2)。根據(jù)此模型,結(jié)晶的B型DNA鈉鹽是由兩條反向平行的多核苷酸鏈,圍繞同一個中心軸構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu)。

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點:

(1) DNA分子由兩條脫氧多核苷酸鏈構(gòu)成,兩條鏈都是右手螺旋,這兩條鏈反向平行(即一條為5"→3",另一條為3"→5",圍繞同一個中心軸構(gòu)成雙螺旋結(jié)構(gòu))。鏈之間的螺旋形成一條大溝和一條小溝。多核苷酸鏈的方向取決于核苷酸間的磷酸二酯鍵的走向(圖4-3)。

圖4-2  右手螺旋DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)(二級結(jié)構(gòu))模型(a)及其圖解(b)

圖4-3  DNA分子中多核苷酸鏈的方向

(2) 磷酸基和脫氧核糖在外側(cè),彼此之間通過磷酸二酯鍵相連接,形成DNA的骨架。堿基連接在糖環(huán)的內(nèi)側(cè)。糖環(huán)平面與堿基平面相互垂直。

(3) 雙螺旋的直徑為2nm。順軸方向,每隔0.34nm有一個核苷酸,兩個相鄰核苷酸之間的夾解為36°。每一圈雙螺旋有10對核苷酸,每圈高度為3.4nm。

(4) 兩條鏈由堿基間的氫鍵相連,而且堿基間形成氫鍵有一定規(guī)律:腺嘌呤與胸腺嘧啶成對,鳥嘌呤與胞嘧啶成對。A和T間形成兩個氫鍵,G和C間形成三個氫鍵。這種堿基之間互相配對稱為堿基互補(bǔ)(圖4-4)。

圖4-4  DNA分子中的A=T,G≡C配對(長度單位為nm)

因此,當(dāng)一條多核苷酸鏈的堿基序列已確定,就可推知另一條互補(bǔ)核苷酸鏈的堿基序列。每種生物的DNA都有其自己特異的堿基序列。

(5) 沿螺旋軸方向觀察,配對的堿基并不充滿雙螺旋的全部空間。由于堿基對的方向性,使jfsoft.net.cn/kuaiji/得堿基對占據(jù)的空間不對稱,因此在雙螺旋的表面形成兩個凹下去的槽,一個槽大些,另一個槽小些,分別稱為大溝和小溝。雙螺旋表面的溝對DNA和蛋白質(zhì)相互識別是很重要的。

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素:

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)是很穩(wěn)定的。主要有三種作用力使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)維持穩(wěn)定。一種作用力是互補(bǔ)堿基之間的氫鍵,但氫鍵并不是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力,因為氫鍵的能量很小。DNA分子中堿基的堆積可以使堿基締合,這種力稱為堿基堆積力,是使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力。堿基堆積力是由于雜環(huán)堿基的π電子之間相互作用所引起的。DNA分子中堿基層層堆積,在DNA分子內(nèi)部形成一個疏水核心。疏水核心內(nèi)幾乎沒有游離的水分子,這有利于互補(bǔ)堿基間形成氫鍵。第三種使DNA分子穩(wěn)定的力是磷酸基的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子的正電荷之間形成的離子鍵。它可以減少DNA分子雙鏈間的靜電斥力,因而對DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)也有一定的穩(wěn)定作用。與DNA結(jié)合的陽離子如Na+、K+、Mg2+、Mn2+,在細(xì)胞中很多。此外,在原核細(xì)胞中DNA常與精胺或亞精胺結(jié)合,真核細(xì)胞中的DNA一般與組蛋白結(jié)合。

天然DNA在不同濕度、不同鹽溶液中結(jié)晶,其X線衍射所得數(shù)據(jù)不一樣,因而M.Wilkins等將DNA的二級結(jié)構(gòu)分為A、B、C三種不同的類型(表4-3)。Watson和Crick提出的結(jié)構(gòu)為B型,溶液和細(xì)胞中天然狀態(tài)的DNA可能是B型。

表4-3  DNA的類型

類  型

結(jié)晶狀態(tài)

螺距(nm)

堆積距離

(nm)

每圈螺旋

堿基對數(shù)

堿基夾角

A

75%相對濕度,鈉鹽

2.8

0.256

11

32.7°

B

92%相對濕度,鈉鹽

3.4

0.34

10

36°

C

66%相對濕度,鋰鹽

3.1

0.332

9.3

38°

因DNA纖維的含水量不同,而形成三種不同的DNA構(gòu)象。A型DNA是相對濕度為75%時制成的DNA鈉鹽纖維,也是右手螺旋。它與B型DNA不同之處是堿基不與縱軸相垂直,而呈20°傾角,所以螺距與每圈螺旋的堿基數(shù)目發(fā)生了改變。A型DNA的螺距不是3.4nm,而是2.8nm,所以每圈螺旋含有11個堿基對。當(dāng)DNA纖維中的水分再減少時,就出現(xiàn)C型,C型DNA可能存在于染色體和某些病毒的DNA中。

2. 左手螺旋DNA 1979年,美國麻省理工學(xué)院A.Rich等從d(GCGCGC)這樣一個脫氧六核苷酸X線衍射結(jié)果發(fā)現(xiàn),該片段以左手螺旋存在于晶體中,并提出了左手螺旋的Z-DNA模型。

Watson和Crick右手螺旋DNA模型是平滑旋轉(zhuǎn)的梯形螺旋結(jié)構(gòu),而新發(fā)現(xiàn)的左手螺旋DNA,雖也是雙股螺旋,但旋轉(zhuǎn)方向與它相反,主鏈中磷原子連接線呈鋸齒形(zigzag),如似Z字形扭曲,因此稱為Z-DNA。Z-DNA直徑約1.8nm,螺距4.5nm,每一圈螺旋含12個堿基對,整個分子比較細(xì)長而伸展。Z-DNA的堿基對偏離中心軸并靠近螺旋外側(cè),螺旋的表面只有小溝沒有大溝。此外,許多數(shù)據(jù)均與B-DNA不同(表4-4)。

表4-4  B-DNA與Z-DNA的比較

類 型

旋轉(zhuǎn)

方向

每圈殘

基數(shù)

直徑

(nm)

堿基堆積

距離(nm)

螺距

(nm)

每個堿基

旋轉(zhuǎn)角度

B-DNA

右旋

10

2.0

3.40

3.40

36°

Z-DNA

左旋

12

1.8

3.7

4.44

-60°

Rich提出的左旋DNA模型雖然來自人工合成的脫氧六核苷酸的實驗結(jié)果,但20世紀(jì)80年代以來一些學(xué)者在多種實驗基礎(chǔ)上,指出左旋DNA也是天然DNA的一種構(gòu)象,而且在一定條件下右旋DNA可轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮,并提出DNA的左旋化可能與致癌、突變及基因表達(dá)的調(diào)控等重要生物功能有關(guān)。

(四) DNA的三級結(jié)構(gòu)

在DNA雙螺旋二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上,雙螺旋的扭曲或再次螺旋就構(gòu)成了DNA的三級結(jié)構(gòu)。超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)的一種形式。超螺旋的形成與分子能量狀態(tài)有關(guān)。

在DNA雙螺旋中,每10個核苷酸旋轉(zhuǎn)一圈,這時雙螺旋處于最低的能量狀態(tài)。如果使正常的雙螺旋DNA分子額外地多轉(zhuǎn)幾圈或少轉(zhuǎn)幾圈,這就會使雙螺旋內(nèi)的原子偏離正常位置。對應(yīng)在雙螺旋分子中就存在額外張力。如果雙螺旋末端是開放的,這種張力可以通過鍵的轉(zhuǎn)動而釋放出來,DNA將恢復(fù)到正常的雙螺旋狀態(tài)。如果DNA兩端是以某種方式固定的,或是成環(huán)狀DNA分子,這些額外的張力不能釋放到分子之外,而只能在DNA內(nèi)部使原子的位置重排,這樣DNA本身就會扭曲,這種扭曲就稱為超螺旋。環(huán)狀DNA都是超螺旋。如果將這種超螺旋用DNA內(nèi)切酶使其切斷一條鏈,螺旋反轉(zhuǎn)形成的張力釋放,超螺旋則能恢復(fù)到低能的松馳狀態(tài)(圖4-5)。超螺旋DNA的體積比環(huán)狀松弛狀DNA更緊縮。已發(fā)現(xiàn)大腸桿菌DNA可形成許多小環(huán),并通過蛋白質(zhì)連接在一起。每一個小環(huán)又形成超螺旋。形成小環(huán)和超螺旋使很大的環(huán)狀DNA分子能夠壓縮成很小的體積而不需要包膜來幫助。

(五) 染色質(zhì)與染色體

DNA的三級結(jié)構(gòu)與其結(jié)合的蛋白質(zhì)有關(guān)。具有三級結(jié)構(gòu)的DNA和組蛋白緊密結(jié)合組成染色質(zhì)。構(gòu)成真核細(xì)胞的染色體物質(zhì)稱為“染色質(zhì)”(chromatin),它們是不定形的,幾乎是隨機(jī)地分散于整個細(xì)胞核中,當(dāng)細(xì)胞準(zhǔn)備有絲分裂時,染色質(zhì)凝集,并組裝成因物種不同而數(shù)目和形狀特異的染色體(chromosome),此時當(dāng)細(xì)胞被染色后,用光學(xué)顯微鏡可以觀察到細(xì)胞核中有一種密度很高的著色實體。因此真核染色體只限于定義體細(xì)胞有絲分裂期間這種特定形狀的實體。所以“染色體”是細(xì)胞有絲分裂期間“染色質(zhì)”的凝集物。

真核細(xì)胞染色質(zhì)中,雙鏈DNA是線狀長鏈,以核小體(nucleosome)的形式串聯(lián)存在。核小體是由組蛋白H2A,H2B,H3和H4各兩分子組成的八聚體,外繞DNA,長約145堿基對,形成所謂的核心顆粒(core particle),實際上需再由組蛋白H1與DNA兩端連接(圖4-6),使DNA圍成兩圈左手超螺旋,共約166堿基對。與組蛋白皆以鹽鍵相聯(lián),形成珠狀核小體。這是染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位。核小體長鏈進(jìn)一步卷曲,每6個核小體為1圈,H1組蛋白在內(nèi)側(cè)相互接觸,形成直徑為30nm的螺旋筒(solenoid)結(jié)構(gòu),組成染色質(zhì)纖維(圖4-7)。在形成染色單體時,螺旋筒再進(jìn)一步卷曲、折疊。人體每個細(xì)胞中長約1.7m的DNA雙螺旋鏈,最終壓縮了8400多倍,分布于各染色單體中;46個染色單體總長僅200μm左右,儲于細(xì)胞核中。

在30nm的核小體纖維中,DNA獲得上百倍的包裝比,而且染色體DNA的某一些部分和“核骨架”(nuclearscaffold)相連接。這些骨架相連接的部分把染色體DNA分隔成許多長度不同的DNA環(huán)(20000至100000堿基對),每個環(huán)(loops)有相對獨立性。當(dāng)一個環(huán)被打斷或被核酸酶所松馳時,其他環(huán)仍可保持超螺旋狀態(tài)。實驗還證實真核染色體,還有更多層次的組織形式,每個層次都使染色體的包裝變得更致密。因此真核染色體DNA包裝是一個纏繞再接一次更高級的纏繞和包裝,這種高層次包裝的模式圖如圖4-8。染色質(zhì)中還存在一些非組蛋白(nonhistone proteins),一些非組蛋白參與了調(diào)節(jié)特殊基因的表達(dá),以控制同種生物的基因組可以在不同組織與器官中表達(dá)出不同生物功能的活性蛋白。

(a)核小體結(jié)構(gòu)模式  (b)核小體纖維模式圖

圖4-6  核小體是DNA與組蛋白的復(fù)合物

圖4-8  真核染色體不同層次的結(jié)構(gòu)包裝模型

(六) 基因與基因組

基因位于染色體上,在一條染色體上有很多基因,代表特定性狀的特定基因與某一條特定染色體上的特定位置相聯(lián)系,因此基因是在染色體上占有一定空間的特定DNA片段。真核生物的體細(xì)胞里每條染色體都有其另一條同源染色體,即一個染色體是由二條染色單體配對存在的,所以體細(xì)胞是二倍體(diploid)細(xì)胞;而生殖細(xì)胞里每條染色體都只有一條,所以是單倍體(haploid)細(xì)胞。二倍體細(xì)胞每一個基因也是成對存在的,每一對基因分別位于來自雙親的染色體的同一位置上,此位置稱基因座(locus),一對同源染色體在同一基因座上的一對基因稱為一對等位基因(allele)。每一個體的每一基因座上只有兩個等位基因、可是在一個群體中,每個基因座上可以有兩個以上等位基因,這就是復(fù)等位基因(multiple allele)。

當(dāng)一個生物體帶有一對完全相同的等位基因時,則該生物體就該基因而言是純合的(homozygous)或可稱純種(true-breeding);反之,如果一對等位基因不相同,則該生物體是雜合的(heterozygous)或可稱雜種(hybrid)。

等位基因各自編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物決定某一性狀,并可因突變而失去功能,等位基因之間存在相互作用,當(dāng)一個等位基因決定生物性狀的作用強(qiáng)于另一等位基因并使生物只表現(xiàn)出其自身的性狀時,就出現(xiàn)顯隱性關(guān)系,作用強(qiáng)的是顯性,作用被掩蓋而不能表現(xiàn)的為隱性,顯性完全掩蓋隱性的是完全顯性(complete dominance),兩者相互作用而出現(xiàn)介于兩者的中間性狀的是不完全顯性(incomplete dominance)。

操縱子模型的建立進(jìn)一步豐富了基因概念。基因不僅是傳遞遺傳信息的載體,同時又具有調(diào)控基他基因表達(dá)活性的功能。操縱子(operon)由操縱基因與它操縱的幾個結(jié)構(gòu)基因連鎖在一起,幾個結(jié)構(gòu)基因由一個啟動子轉(zhuǎn)錄成為一個mRNA,然后翻譯成幾種功能蛋白質(zhì)。操縱基因還受調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏物進(jìn)行調(diào)節(jié),進(jìn)而控制結(jié)構(gòu)基因的功能。這些基因互相制約構(gòu)成了一套基因功能調(diào)節(jié)控制系統(tǒng),使生物在不同環(huán)境下表現(xiàn)出不同的遺傳特性。可見基因是可分的,這不僅體現(xiàn)在基因結(jié)構(gòu)上,而且在功能上也可分為編碼產(chǎn)生某種蛋白質(zhì)子的基因,以及負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)其他基因功能的基因,基因不僅能單獨起作用,而且在每個基因之間還有一個相互制約、反饋調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò),每個基因都在各自的系統(tǒng)中發(fā)揮各自的功能。所以基因可以有其自身的產(chǎn)物,基因也可以沒有產(chǎn)物。這樣,一個基因一種蛋白以及基因是決定合成某種蛋白質(zhì)分子的功能單位的概念也就需要進(jìn)一步拓展其內(nèi)涵了。

生物體基因組由整套染色體組成,一條染色體就是一個雙鏈DNA分子,DNA分子中的全部核苷酸序列分別構(gòu)成了基因和各種結(jié)構(gòu)單元。基因組的DNA分子,也可劃分為基因的編碼序列和非編碼序列。分析解剖基因組內(nèi)多種DNA序列的結(jié)構(gòu)特征,有助于解讀這些DNA序列中包含的遺傳信息,認(rèn)識其生物學(xué)功能,以其最終認(rèn)識所有生物的遺傳本性。基因組DNA序列按其結(jié)構(gòu)和功能可分成以下幾類:

1. 基因序列和非基因序列 基因序列指基因組決定蛋白質(zhì)(或RNA產(chǎn)物)的DNA序列,一端為ATG起始密碼子,另一端則是終止密碼子。非基因序列則是基因組中除基因序列以外的所有DNA序列,主要是兩個基因之間的間插序列。

2. 編碼序列和非編碼序列 編碼序列指編碼RNA和蛋白質(zhì)的DNA序列。由于基因是由內(nèi)含子和外顯子組成,內(nèi)含子是基因內(nèi)的非蛋白編碼序列。所以內(nèi)含子序列以及居間序列統(tǒng)稱為非蛋白質(zhì)編碼序列。

3. 單一序列和重復(fù)序列 單一序列是基因組里只出現(xiàn)一次的DNA序列。重復(fù)序列指在基因組里重復(fù)出現(xiàn)的DNA序列;蚪M內(nèi)的重復(fù)序列有的是分散分布,有的是成簇存在。根據(jù)DNA序列在基因組中的重復(fù)頻率,可將其分為輕度重復(fù)序列,中度重復(fù)序列和高度重復(fù)序列。

基因組學(xué)(genomics)是研究生物體基因和基因組的結(jié)構(gòu)組成,穩(wěn)定性及功能的一門學(xué)科。它包括結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(structural genomics)和功能基因組學(xué)(functional genomics)。前者是研究基因和基因組的結(jié)構(gòu),各種遺傳元件的序列特征,基因組作圖和基因定位等;后者是研究不同的序列具有的不同功能,基因表達(dá)的調(diào)控,基因和環(huán)境之間(包括基因與基因,基因與其他DNA序列,基因與蛋白質(zhì))的相互作用等。

二、RNA的種類和分子結(jié)構(gòu)

(一) RNA的類型

根據(jù)結(jié)構(gòu)、功能不同,動物、植物和微生物細(xì)胞的RNA主要有三類:核蛋白體RNA(ribosomal RNA,rRNA),轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transferRNA,tRNA),信使RNA(messenger RNA,mRNA)。

1. 核蛋白體RNA 核蛋白體RNA是細(xì)胞中主要的一類RNA,rRNA占細(xì)胞中全部RNA的80%左右,是一類代謝穩(wěn)定、分子量最大的RNA,存在于核蛋白體內(nèi)。

核蛋白體(ribosome)又稱為核糖體或核糖核蛋白體。它是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成的場所。在迅速生長著的大腸桿菌中,核蛋白體約占細(xì)胞干物質(zhì)的60%。每個細(xì)菌細(xì)胞約含16×103個核蛋白體。每個真核細(xì)胞約有1×106個核蛋白體。原核生物核蛋白體中蛋白質(zhì)約占1/3,rRNA約占2/3;真核生物核蛋白體中蛋白質(zhì)和rRNA各占一半。核蛋白體由兩個亞基組成,一個稱為大亞基,另一個稱為小亞基,兩個亞基都含有rRNA和蛋白質(zhì),但其種類和數(shù)量卻不相同。

S為沉降系數(shù)單位。1個S單位=1×10-13

大腸桿菌核蛋白體的沉降系數(shù)為70×10-13秒,用S單位表示則為70S。

2. 轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(轉(zhuǎn)移RNA)  轉(zhuǎn)運(yùn)RNA是細(xì)胞中一類最小的RNA,tRNA一般由73~93個核苷酸構(gòu)成,分子量23 000~28000。在已測定核苷酸序列的tRNA中,鏈最短的為63個核苷酸,如牛心線粒體絲氨酸t(yī)RNA,鏈最長的有93個核苷酸,如大腸桿菌絲氨酸t(yī)RNA。tRNA的沉降系數(shù)為4S。tRNA約占細(xì)胞中RNA總量的15%。在蛋白質(zhì)生物合成中tRNA起攜帶氨基酸的作用。細(xì)胞內(nèi)tRNA的種類很多,每一種氨基酸都有與其相對應(yīng)的一種或幾種tRNA。

3. 信號RNA mRNA在細(xì)胞中含量很少,占RNA總量的3%~5%。mRNA在代謝上很不穩(wěn)定,它是合成蛋白質(zhì)的模板,每種多肽鏈都由一種特定的mRNA負(fù)責(zé)編碼。因此,細(xì)胞內(nèi)mRNA的種類很多。mRNA的分子量極不均一,其沉降系數(shù)在4~25S間,mRNA的平均分子量約500000。大腸桿菌的mRNA平均含有900~1500個核苷酸。真核mRNA中最大的是絲心蛋白mRNA,它由19 000個核苷酸組成。

除上述三類RNA以外,細(xì)胞內(nèi)還有一些其他類型的RNA,如細(xì)胞核內(nèi)的不均一核RNA(HnRNA,heterogeneousnuclear RNA)、核小RNA(SnRNA, small nuclear RNA)和染色體RNA(ChRNA, chromosomal RNA)等。

近年的研究表明,一些長度較短的RNA,即所謂“小核糖核酸”(SnRNA)能夠?qū)?xì)胞和基因的很多行為進(jìn)行調(diào)控,比如打開或關(guān)閉多種基因,刪除一些不需要的DNA片段等,SnRNA在核糖體生物合成中調(diào)控作用的確定,使rRNA加工中的許多難點獲得突破。SnRNA在細(xì)胞分裂過程中也發(fā)揮重要調(diào)控作用,可指導(dǎo)染色體的物質(zhì)形成正確的結(jié)構(gòu)。這些發(fā)現(xiàn)有望為操作干細(xì)胞提供新工具以及用于研究治療癌癥等由于基因組錯誤所導(dǎo)致的疾病的新方法。

 (二) RNA的結(jié)構(gòu)特征

(1) RNA的基本組成單位是AMP、GMP、CMP及UMP。一般含有較多種類的稀有堿基核苷酸,如假尿嘧啶核苷酸及帶有甲基化堿基的多種核苷酸等。

(2) 每分子RNA中約含有幾十個至數(shù)千個NMP,與DNA相似,彼此通過3",5"-磷酸二酯鍵連接而成多核苷酸鏈。

(3) RNA主要是單鏈結(jié)構(gòu),但局部區(qū)域可卷曲形成雙鏈螺旋結(jié)構(gòu),或稱發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin structure)。雙鏈部位的堿基一般也彼此形成氫鍵而互相配對,即A—U及G—C,雙鏈區(qū)有些不參加配對的堿基往往被排斥在雙鏈外,形成環(huán)狀突起(圖4-9)。

(4) RNA與DNA對堿的穩(wěn)定性不同,RNA易被堿水解,使5"-磷酸酯鍵斷開,形成3"-磷酸酯鍵的單核苷酸。DNA無2"-羥基,則不易被堿水解。

(三) 參與蛋白質(zhì)生物合成的三類RNA的結(jié)構(gòu)

細(xì)胞內(nèi)RNA分子的主要生物功能是參與蛋白質(zhì)的生物合成,主要有三大類,即核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA),轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA,tRNA)及信使RNA(mssenger RNA,mRNA)。

1. tRNA的結(jié)構(gòu) 每一種氨基酸都有2~6種相應(yīng)的tRNA,分散于胞液中。書寫各種不同氨基酸的tRNA時,在右上角注以氨基酸縮寫符號,如tRNAPhe代表轉(zhuǎn)運(yùn)苯丙氨酸的tRNA。

(1) 一級結(jié)構(gòu):tRNA皆由70~90個核苷酸組成,有較多的稀有堿基核苷酸,3"-末端為—C—C—AOH,沉降系數(shù)都在4S左右。

(2) 二級結(jié)構(gòu):根據(jù)堿基排列模式,呈三葉草式(clover leaf)。雙鏈互補(bǔ)區(qū)構(gòu)成三葉草的葉柄,突環(huán)(loop)好像三片小葉。大致分為氨基酸臂、二氫尿嘧啶環(huán)、反密碼環(huán)、額外環(huán)和TφC環(huán)等5部分(圖4-10)。

圖4-10  酵母tRNAAla的核苷酸序列

hU:二氫尿苷酸  Ⅰ:次黃苷酸  m1G:1-甲基鳥苷酸  m1Ⅰ:1-甲基次黃苷酸  m22G:N2-二甲基鳥苷酸φ:假尿苷酸

①氨基酸臂:由7對堿基組成,富含鳥嘌呤。末端為—CCA。蛋白質(zhì)生物合成時,用于連接活化的相應(yīng)氨基酸;②二氫尿嘧啶環(huán)(DhU loop):由8~12個核苷酸組成,含有二氫尿嘧啶,故稱為二氫尿嘧啶環(huán);③反密碼環(huán):由7個核苷酸組成。環(huán)的中間是反密碼子(anticodon),由3個堿基組成,次黃嘌呤核苷酸常出現(xiàn)于反密碼子中;④額外環(huán)(extra loop):由3~18個核苷酸組成。不同的tRNA,此環(huán)大小不一,是tRNA分類的指標(biāo);⑤TφC環(huán):由7個核苷酸組成。因環(huán)中含有T—φ—C堿基序列,故名。

(3)三級結(jié)構(gòu):酵母tRNAPhe呈倒L形的三級結(jié)構(gòu)。其他tRNA也類似。氨基酸臂與TφC臂形成一個連續(xù)的雙螺旋區(qū)(圖4-11),構(gòu)成字母L下面的一橫,二氫尿嘧啶臂與反密碼臂及反密碼環(huán)共同構(gòu)成L的一豎。二氫尿嘧啶環(huán)中的某些堿基與TφC環(huán)及額外環(huán)中的某些堿基之間可形成一些額外的堿基對,維持了tRNA的三級結(jié)構(gòu)。大腸桿菌的起始tRNAmet、tRNAArg及酵母tRNAAsp都與此類似,但L兩臂夾角有些差別。

圖4-11  tRNAphe的三級結(jié)構(gòu)

2. mRNA的結(jié)構(gòu) mRNA為傳遞DNA的遺傳信息并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類RNA分子。mRNA占細(xì)胞內(nèi)RNA總量的2%~5%,代謝活躍,更新迅速,半衰期一般較短。

(1)分子量大小不一,由幾百至幾千個核苷酸組成。

(2)極大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在3"末端有一段長約200個堿基的多聚腺苷酸(polyA)。

(3)真核mRNA的5"末端有一特殊結(jié)構(gòu):7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸,稱為帽子結(jié)構(gòu),與蛋白質(zhì)生物合成的起始有關(guān),其結(jié)構(gòu)如下:

7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸(M7G5’PPP5’NP)

(4)mRNA分子中有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。編碼區(qū)是所有mRNA分子的主要結(jié)構(gòu)部分,該區(qū)域編碼特定蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu),非編碼區(qū)與蛋白質(zhì)合成的調(diào)控有關(guān)。

(5)每分子mRNA可與幾個至幾十個核糖體結(jié)合成串珠樣的多核糖體(polysome)。

mRNA是在核蛋白體將記錄在DNA分子中的遺傳信息轉(zhuǎn)化成蛋白質(zhì)氨基酸順序時的模板。mRNA的核苷酸排列順序與基因DNA核苷酸順序互補(bǔ)。每個細(xì)胞約在104分子mRNA。mRNA是單鏈RNA,其長度變化很大。mRNA的長度取決于它所指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)長度。例如,如果一個蛋白質(zhì)含有100個氨基酸,那么編碼合成這種蛋白質(zhì)的mRNA至少需要300個核苷酸長度,因為三個核苷酸編碼一個氨基酸。但是,實際上,mRNA的長度一般都比指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成所需要的核苷酸鏈長度為長。這是因為分子中有些區(qū)段是不參加翻譯的區(qū)段。

原核細(xì)胞的mRNA具有下列結(jié)構(gòu)特點:

(1)包括細(xì)胞和病毒的原核細(xì)胞mRNA一般都為多順反子結(jié)構(gòu),即一個單鏈mRNA分子可作為多種多肽和蛋白肽鏈合成的模板。

(2)原核細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯是耦合的,即mRNA分子一邊進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,同時一邊進(jìn)行翻譯。

(3)原核細(xì)胞mRNA分子包含有先導(dǎo)區(qū)、翻譯區(qū)和非翻譯區(qū),即在二個順反子之間有不參加翻譯的插入順序。

與原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)相比較,真核細(xì)胞mRNA的結(jié)構(gòu)具有以下明顯不同特點:

(1)極大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA的3"末端有一段多聚腺苷酸(polyA+),其長度約200個腺苷酸。原核細(xì)胞mRNA3"末端一般不含polyA+順序。而polyA+的結(jié)構(gòu)與mRNA從細(xì)胞核移至細(xì)胞質(zhì)過程有關(guān),也與mRNA的半衰期有關(guān)。新合成的mRNA polyA+較長,衰老mRNA的polyA+較短;另外,真核細(xì)胞mRNA的5"-末端有一個特殊結(jié)構(gòu)—7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸(通常有三種類型m7G5PPP5NP,m7G5PPP5N"mPNP和m7G5PPP5N"mPNmP)這種結(jié)構(gòu)簡稱帽子結(jié)構(gòu),原核生物mRNA無帽子結(jié)構(gòu)。

(2)真核細(xì)胞mRNA一般為單順反子(即一個mRNA分子只為一種多肽編碼)。

(3)真核細(xì)胞mRNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯是分開進(jìn)行的,先在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體mRNA(核不均一RNA,即HnRNA),轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿內(nèi)后,再在核外加工為成熟mRNA,然后起翻譯作用。

3. rRNA結(jié)構(gòu) rRNA分子大小不均一。真核細(xì)胞的rRNA有4種,其沉降系數(shù)分別為58S,5.8S,5S和18S,大約與70種蛋白質(zhì)結(jié)合而存在于細(xì)胞質(zhì)的核蛋白體的大小兩個亞基中。5sRNA與tRNA相似,具有類似三葉草型的二級結(jié)構(gòu)。

其他RNA,如16SrRNA,23S rRNA及病毒RNA也是由部分雙螺旋結(jié)構(gòu)和部分突環(huán)相間排列組成的。由DNA轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物總是單鏈RNA,單鏈RNA趨向于右手螺旋構(gòu)象,其構(gòu)象基礎(chǔ)是由堿基堆積而成的(圖4-12)。由于嘌呤基之間的堆積力比嘌呤基與嘧啶基或嘧啶基與嘧啶基之間的堆積力強(qiáng),因此嘧啶堿基常常被擠出而形成兩個嘌呤堿基的相互作用。RNA能和具有互補(bǔ)順序的RNA或DNA鏈進(jìn)行堿基配對。

與雙鏈DNA不同,RNA沒有一個簡單的有規(guī)律的二級結(jié)構(gòu)。在有互補(bǔ)順序的地方形成的雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)主要是A型右手螺旋。由于錯配或無配對堿基常常打斷螺旋,而在RNA分子中間形成“突起”和“環(huán)”,在RNA鏈內(nèi)最近的自身互補(bǔ)順序能形成發(fā)卡環(huán)(圖4-13)。RNA分子中形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)是RNA具有的最普遍的二級結(jié)構(gòu)形式。

有些短序列如uuGG序列,常常存在于RNA發(fā)卡結(jié)構(gòu)的末端,形成結(jié)實穩(wěn)定的環(huán),在形成RNA分子的三維結(jié)構(gòu)中起重要作用,氫鍵是RNA三維

結(jié)構(gòu)的另一種維持作用力。在rRNA分子中存在大量氫鍵配對,分子中含有許多基環(huán)結(jié)構(gòu),尤其是大的rRNA分子,存在許多螺旋區(qū)和環(huán)區(qū),每個區(qū)域在結(jié)構(gòu)上和功能上都是相對獨立的單位,因此盡管有些rRNA的一級結(jié)構(gòu)序列不同,但它們的三維結(jié)構(gòu)卻十分類似(圖4-14)。

(a)E.coli 16-s-rRNA (b)酵母16-S-rRNA

圖4-14  大腸桿菌與釀酒酵母16-S-rRNAs的三維結(jié)構(gòu)

(兩種來源不同的16-S-rRNAs,雖然一級結(jié)構(gòu)不同,但它們的三維結(jié)構(gòu)卻十分近似。)

第三節(jié) 核酸的理化性質(zhì)

一、 核酸的分子大小

采用電子顯微鏡照相及放射自顯影等技術(shù),已能測定許多完整DNA的分子量。噬菌體T2DNA的電鏡像顯示整個分子是一條連續(xù)的細(xì)線,直徑為2nm,長度為(49±4)μm。由此計算其分子量約為1×108。大腸桿菌染色體DNA的放射自顯影像為一環(huán)狀結(jié)構(gòu),其分子量約2×109。真核細(xì)胞染色體中的DNA分子量更大。果蠅巨染色體只有一條線形DNA,長達(dá)4.0cm,分子量約為8×1010,為大腸桿菌DNA的40倍。RNA分子比DNA短得多,其分子量只達(dá)(2.3~110)×104

二、 核酸的溶解度與粘度

RNA和DNA都是極性化合物,都微溶于水,而不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑。它們的鈉鹽比自由酸易溶于水,RNA鈉鹽在水中溶解度可達(dá)4%。

高分子溶液比普通溶液粘度要大得多,不規(guī)則線團(tuán)分子比球形分子的粘度大,而線性分子的粘度更大。由于天然DNA具有雙螺旋結(jié)構(gòu),分子長度可達(dá)幾厘米,而分子直徑只有2nm,分子極為細(xì)長,因此,即使是極稀的DNA溶液,粘度也極大。RNA分子比DNA分子短得多,RNA呈無定形,不像DNA那樣呈纖維狀,RNA的粘度比DNA粘度小。當(dāng)DNA溶液加熱,或在其他因素作用下發(fā)生螺旋→線團(tuán)轉(zhuǎn)變時,粘度降低。所以可用粘度作為DNA變性的指標(biāo)。

三、 核酸的酸堿性質(zhì)

多核苷酸中兩個單核苷酸殘基之間的磷酸殘基的解離具有較低的pK"值(pK"=1.5),所以當(dāng)溶液的pH高于4時,全部解離,呈多陰離子狀態(tài)。因此,可以把核酸看成是多元酸,具有較強(qiáng)的酸性。核酸的等電點較低,酵母RNA(游離狀態(tài))的等電點為pH2.0~2.8。多陰離子狀態(tài)的核酸可以與金屬離子結(jié)合成鹽。一價陽離子如Na+、K+,兩價陽離子如Mg2+、Mn2+等都可與核酸形成鹽。核酸鹽的溶解度比游離酸的溶解度要大得多。多陰離子狀態(tài)的核酸也能與堿性蛋白,如組蛋白等結(jié)合。病毒與細(xì)菌中的DNA常與精胺、亞精胺等多陽離子胺類結(jié)合,使DNA分子具有更大的穩(wěn)定性與柔韌性。

由于堿基對之間氫鍵的性質(zhì)與其解離狀態(tài)有關(guān),而堿基的解離狀態(tài)又與pH有關(guān),所以溶液中的pH直接影響核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基對之間氫鍵的穩(wěn)定性。對DNA來說堿基對在pH4.0~11.0之間最為穩(wěn)定。超越此范圍,DNA就要變性。

四、 核酸的紫外吸收

由于核酸的組成成分嘌呤及嘧啶堿具有強(qiáng)烈的紫外吸收,所以核酸也有強(qiáng)烈的紫外吸收。最大吸收值在260nm處(圖4-12)。利用這一特性,可以鑒別核酸樣品中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。

利用核酸的紫外吸收特性,還可對核酸進(jìn)行定量測定。由于核酸制品的純度不一,分子量大小不同,所以很難以核酸的重量來表示它的克分子消光系數(shù)。因核酸分子中堿基和磷原子的含量相等,因此可以根據(jù)磷的含量測定核酸溶液的吸收值。以每升的核酸溶液中1克原子磷為標(biāo)準(zhǔn)來計算核酸的消光系數(shù),就叫克原子磷消光系數(shù)e(p)。

e(p)=

式中:A為吸收值,C為每升溶液中磷的克原子數(shù),L為比色杯內(nèi)徑的厚度。由于:

C=

所以上式可改寫成:

e(p)=

這樣,只要測定核酸溶液的磷含量和紫外吸收值,就可以求得它的e(p)值。一般,DNA的e(p)值均較其所含核苷酸單體的e(p)值的總和要低20%~60%。降低程度與核酸分子中雙鏈結(jié)構(gòu)多少有關(guān)。核酸在變性時,e(p)值顯著升高,此現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)(hyperchromic effect)(圖4-12)。在一定條件下,變性核酸可以復(fù)性,此時e(p)值又回復(fù)至原來水平,這一現(xiàn)象叫減色效應(yīng)(hypochromic effect)。所以,e(p)值可作為核酸復(fù)性的指標(biāo)。減色效應(yīng)是由于在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堆積的堿基之間的電子相互作用,而減低了對紫外光的吸收。

五、 核酸的變性、復(fù)性和雜交

(一) 變性

核酸分子具有一定的空間結(jié)構(gòu),維持這種空間結(jié)構(gòu)的作用力主要是氫鍵和堿基堆積力。有些理化因素會破壞氫鍵和堿基堆積力,使核酸分子的空間結(jié)構(gòu)改變,從而引起核酸理化性質(zhì)和生物學(xué)功能改變,這種現(xiàn)象稱為核酸的變性。核酸變性時,其雙螺旋結(jié)構(gòu)解開,但并不涉及核苷酸間共價鍵的斷裂,因此變性作用并不引起核酸分子量降低。多核苷酸鏈的磷酸二酯鍵的斷裂叫降解。伴隨核酸的降解,核酸分子量降低。

多種因素可引起核酸變性,如加熱、過高過低的pH、有機(jī)溶劑、酰胺和尿素等。加熱引起DNA的變性稱為熱變性。將DNA的稀鹽溶液加熱到80~100℃幾分鐘,雙螺旋結(jié)構(gòu)即被破壞,氫鍵斷裂,兩條鏈彼此分開,形成無規(guī)則線團(tuán)。這一變化稱為螺旋→線團(tuán)轉(zhuǎn)變(圖4-13)。隨著DNA空間結(jié)構(gòu)的改變,引起一系列性質(zhì)變化,如粘度降低,某些顏色反應(yīng)增強(qiáng),尤其是260nm紫外吸收增加,DNA完全變性后,紫外吸收能力增加25%~40%。DNA變性后失去生物活性。DNA熱變性的過程不是一種“漸變”,而是一種“躍變”過程,即變性作用不是隨溫度的升高徐徐發(fā)生,而是在一個很狹窄的臨界溫度范圍內(nèi)突然引起并很快完成,就像固體的結(jié)晶物質(zhì)在其融點時突然融化一樣。通常把e(p)值達(dá)到最高值的1/2時的溫度稱為“熔點”或熔解溫度(melting temperature),用符號Tm表示。DNA的Tm值一般在70~85℃之間(圖4-14)。

DNA的Tm值與其分子中的G—C含量呈正比關(guān)系,G—C對含量越多,Tm值就越高,這是因為G—C對之間有三個氫鍵,所以含G—C對多的DNA分子更為穩(wěn)定。而G—C對含量低,則Tm值低。因此測定Tm可推算DNA分子中G—C對含量,其經(jīng)驗公式為:

(G+C)%=(Tm-69.3)×2.44

Tm值還受介質(zhì)中離子強(qiáng)度的影響,一般說,在離子強(qiáng)度較低的介質(zhì)中,DNA的熔解溫度較低,而離子強(qiáng)度較高時,DNA的Tm值也較高。所以DNA制品不應(yīng)保存在極稀的電解質(zhì)溶液中,一般在1mol/L氯化鈉溶液中保存較為穩(wěn)定。

圖4-13  DNA的變性過程

RNA也具有螺旋→線團(tuán)之間的轉(zhuǎn)變。但由于RNA只有局部的雙螺旋區(qū),所以這種轉(zhuǎn)變不如DNA那樣明顯。變性曲線不那么陡,Tm值較低。tRNA具有較多的雙螺旋區(qū),所以具有較高的Tm值,變性曲線也較陡。RNA變性后紫外吸收值約增加1.1%。

(二) 復(fù)性

變性DNA在適當(dāng)條件下,可使兩條彼此分開的鏈重新由氫鍵連接而形成雙螺旋結(jié)構(gòu),這一過程叫復(fù)性(renaturation)。復(fù)性后DNA的一系列物理化學(xué)性質(zhì)得到恢復(fù),如e(p)值降低,粘度增高,生物活性部分恢復(fù)。通常以e(p)值的改變作為復(fù)性的指標(biāo)。將熱變性DNA驟然冷卻至低溫時,DNA不可能復(fù)性,而在緩慢冷卻時才可以復(fù)性。

(三) 核酸的雜交

將不同來源的DNA經(jīng)熱變性,冷卻,使其復(fù)性,在復(fù)性時,如這些異源DNA之間在某些區(qū)域有相同的序列,則會形成雜交DNA分子。DNA與互補(bǔ)的RNA之間也會發(fā)生雜交。核酸雜交(hybridization)可以在液相或固相載體上進(jìn)行。

最常用的是以硝酸纖維素膜作為載體進(jìn)行雜交。英國分子生物學(xué)家E.M.Southern創(chuàng)立的Southerm印跡法(Southernblotting)就是將凝膠電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上后,再進(jìn)行雜交。其操作是將DNA樣品經(jīng)限制性內(nèi)切酶降解后,用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段,將膠浸泡在NaOH中進(jìn)行DNA變性,然后將變性DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上在80℃烤4~6小時,使DNA固定在膜上,再與標(biāo)記的變性DNA探針進(jìn)行雜交,雜交反應(yīng)在較高鹽濃度和適當(dāng)溫度(68℃)下進(jìn)行10多小時,經(jīng)洗滌除去未雜交的標(biāo)記探針、將纖維素膜烘干后進(jìn)行放射自顯影即可鑒定待分析的DNA片段。除DNA外,RNA也可用作探針(probe)?捎32P標(biāo)記探針、也可用生物素標(biāo)記探針。

將RNA經(jīng)電泳變性后轉(zhuǎn)移至纖維素膜上再進(jìn)行雜交的方法稱Northern印跡法(Northernblotting)。根據(jù)抗體與抗原可以結(jié)合的原理,用類似方法也可以分析蛋白質(zhì),這種方法稱Western印跡法(Western blotting)。應(yīng)用核酸雜交技術(shù),可以分析含量極少的目的基因,是研究核酸結(jié)構(gòu)與功能的一個極其有用的工具。

第四節(jié) 核酸的分離與含量測定

一、 核酸的提取、分離和純化

提取核酸的一般原則是先破碎細(xì)胞,提取核蛋白使其與其他細(xì)胞成分分離。然后用蛋白質(zhì)變性劑如苯酚或去垢劑(十二烷基硫酸鈉)等,或用蛋白酶處理除去蛋白質(zhì)。是后所獲得的核酸溶液用乙醇等使其沉淀。

在提取、分離、純化過程中應(yīng)特別注意防止核酸的降解。為獲得天然狀態(tài)的核酸,在提取過程中,應(yīng)防止核酸酶、化學(xué)因素和物理因素所引起的降解。

為了防止內(nèi)源性核酸酶對核酸的降解,在提取和分離核酸時,應(yīng)盡量降低核酸酶的活性。通常加入核酸酶的抑制劑。在核酸的提取過程中常用酸堿,所以在提取時應(yīng)注意強(qiáng)酸強(qiáng)堿對核酸的化學(xué)降解作用。核酸(特別是DNA)是大分子,高溫、機(jī)械作用力等物理因素均可破壞核酸分子的完整性。因此核酸的提取過程應(yīng)在低溫(0℃左右)以及避免劇烈攪拌等條件下進(jìn)行。

(一) DNA的分離純化

真核細(xì)胞中DNA以核蛋白形式存在。DNA蛋白(DNP)在不同濃度的氯化鈉溶液中溶解度顯著不同。DNP溶于水,在0.14mol/L氯化鈉溶液中溶解度最小,僅為水中溶解度的1/100。當(dāng)氯化鈉濃度再增加時,其溶解度又增加,例如在0.5mol/L時溶解度與水相似,而當(dāng)氯化鈉增至1mol/L時,DNP溶解度較在水中大兩倍以上。利用這一性質(zhì)可將DNP從破碎后的細(xì)胞勻漿中分離出來,也可以使DNA蛋白和RNA蛋白分離,因為DNA蛋白不溶于0.14mol/L氯化鈉溶液,而RNA蛋白溶于0.14mol/L氯化鈉溶液。DNA蛋白的蛋白部分可用下列方法除去:

用苯酚提。核柡偷男抡麴s苯酚與DNP振蕩后,冷凍離心。DNA溶于上層水相中,中間殘留物也雜有部分DNA,變性蛋白質(zhì)在酚層內(nèi)。這種操作需要反復(fù)多次。將含DNA的水相合并后,加入相當(dāng)于2.5倍體積的冷水無水乙醇,可將DNA沉淀出來。此時DNA呈十分粘稠的物質(zhì),可用玻璃棒繞成一團(tuán),jfsoft.net.cn/rencai/取出。由于苯酚能使蛋白質(zhì)迅速變性,當(dāng)然也抑制了核酸酶的降解作用。整個操作條件比較緩和,可用此法得到天然狀態(tài)的DNA。

用三氯甲烷-戊醇提。簩NP溶液和等體積的三氯甲烷-戊醇(3∶1)劇烈振蕩,離心,上層水液含DNA、蛋白質(zhì),下層為三氯甲烷和戊醇,兩層之間為蛋白質(zhì)凝膠。上層水相再用三氯甲烷-戊醇的混合液處理,并反復(fù)數(shù)次,至兩層之間無蛋白質(zhì)膠狀物為止。

去污劑法:用十二烷基硫酸鈉(SDS)等去污劑可使蛋白質(zhì)變性。用這種方法可以獲得一種很少降解,而又可以復(fù)制的DNA制品。

酶法:用廣譜蛋白酶使蛋白質(zhì)水解。DNA制品中有少量RNA雜質(zhì),可用核糖核酸酶除去。

檸檬酸鈉有抑制脫氧核糖核酸酶(DNase)的作用。制備DNA時,常用它來防止DNase引起的降解。由于DNase作用時需要Mg2+,而檸檬酸鈉作為一種螯合劑,可以除去Mg2+,所以有抑制DNase的作用。

天然的DNA分子有的呈線性,有的呈環(huán)形。采用下列方法可以將不同構(gòu)象的DNA分離。

蔗糖梯度區(qū)帶超離心,可按DNA分子的大小和形狀進(jìn)行分離。

氯化銫密度梯度平衡超離心,可按DNA的浮力密度不同進(jìn)行分離。雙鏈DNA中如插入溴化乙錠等染料后,可以減低其浮力密度。但由于超螺旋狀態(tài)的環(huán)狀DNA中插入溴化乙錠的量比線狀或開環(huán)DNA分子少,所以前者的浮力密度降低較小。因此,可將這幾類DNA進(jìn)行分離。

羥甲基磷灰石和甲基白蛋白硅藻土柱層析也是常用的純化DNA的方法。

RNA和DNA雜交已廣泛地應(yīng)用于基因分離。在應(yīng)用分子雜交純化基因的工作中最初是用硝酸纖維素方法。硝酸纖維素可以吸附變性DNA,但天然DNA和RNA不被吸附。RNA-DNA雜交體仍有游離的變性DNA區(qū),所以也能被吸附。洗脫不吸附的DNA、RNA等雜質(zhì),再分別將變性DNA和雜交RNA-DNA洗脫下來,如此則可得到純化的DNA。

(二) RNA的分離純化

細(xì)胞內(nèi)主要的RNA有三類:mRNA、rRNA和tRNA。目前在實驗室先將細(xì)胞勻漿進(jìn)行差速離心,制得細(xì)胞核、核蛋白體和線粒體等細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)。然后再從這些細(xì)胞器分離某一類RNA。從核蛋白體分離rRNA,從多聚核蛋白體分離mRNA,從線粒體分離線粒體DNA和RNA。從細(xì)胞核可以分離核內(nèi)RNA,從細(xì)胞質(zhì)可以分離各種tRNA。

RNA在細(xì)胞內(nèi)也常和蛋白質(zhì)結(jié)合,所以必須除去蛋白質(zhì)。從RNA提取液中除去蛋白質(zhì)的方法有以下幾種:

(1) 在10%氯化鈉溶液中加熱至90℃,離心除去不溶物,加乙醇使RNA沉淀,或者調(diào)節(jié)pH至等電點使RNA沉淀。

(2) 用鹽酸胍(最終濃度2mol/L)可溶解大部分蛋白質(zhì),冷卻,RNA即沉淀析出。粗制品再用三氯甲烷除去少量殘余蛋白質(zhì)。

(3) 去污劑法,常用的為十二烷基硫酸鈉(SDS),使蛋白質(zhì)變性。

(4) 苯酚法,可用90%苯酚提取,離心后,蛋白質(zhì)和DNA留在酚層,而RNA在上層水相內(nèi),然后進(jìn)一步分離。

制備RNA時常用的RNA酶抑制劑如皂土,皂土有吸附RNA酶的能力。

RNA制品中往往混有鏈長不等的多核苷酸。這些多核苷酸或者是不同類型的RNA,或者是RNA的降解產(chǎn)物?梢圆捎孟铝蟹椒右赃M(jìn)一步純化,得到均一的RNA制品:

蔗糖梯度區(qū)帶超離心,可將18S、28S、4S RNA分開。

聚丙烯酰胺凝膠電泳,可將不同類型的RNA分開。

甲基白蛋白硅藻土柱、羥基磷灰石柱、各種纖維素柱,都常用來分級分離各種類型的RNA。寡聚dT-纖維素柱用于分離mRNA,效果很好。凝膠過濾法也是分離RNA的有用方法。分離mRNA還可用親和層析法和免疫法。

二、 核酸含量測定的原理

(一) 定磷法

RNA和DNA中都含有磷酸,根據(jù)元素分析獲知RNA的平均含磷量為9.4%,DNA的平均含磷量為9.9%。因此,可從樣品中測得的含磷量來計算RNA或DNA的含量。

用強(qiáng)酸(如10mol/L硫酸)將核酸樣品消化,使核酸分子中的有機(jī)磷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機(jī)磷,無機(jī)磷與鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸,磷鉬酸在還原劑(如抗壞血酸、α-1,2,4-氫基萘酚磺酸、氯化亞錫等)作用下還原成鉬藍(lán)?捎帽壬y定RNA樣品中的含磷量。

(二) 定糖法

RNA含有核糖,DNA含有脫氧核糖,根據(jù)這兩種糖的顏色反應(yīng)可對RNA和DNA進(jìn)行定量測定。

1. 核糖的測定 RNA分子中的核糖和濃鹽酸或濃硫酸作用脫水生成糠醛?啡┡c某些酚類化合物縮合而生成有色化合物。如糠醛與地衣酚(3,5-二羥甲苯)反應(yīng)產(chǎn)生深綠色化合物,當(dāng)有高鐵離子存在時,則反應(yīng)更靈敏。

反應(yīng)產(chǎn)物在660nm有最大吸收。并且與RNA的濃度成正比。

2. 脫氧核糖的測定 DNA分子中的脫氧核糖和濃硫酸作用,脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊醛,與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色化合物。

反應(yīng)產(chǎn)物在595nm處有最大吸收,并且與DNA濃度成正比。

(三) 紫外吸收法

利用核酸組分嘌呤環(huán)、嘧啶環(huán)具有紫外吸收的特性。用這種方法測定核酸含量時,通常規(guī)定在260nm,測得樣品DNA或RNA溶液的A260值,即可計算出樣品中核酸的含量。

(吳梧桐)

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